ICS65.020.30 B 50 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T7221-2016 蛙病毒检测方法 Detectionmethodofranavirus 行业标准信息服务平台 2016-12-23发布 2017-04-01实施 中华人民共和国农业部 发布 SC/T7221—2016 前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口。 本标准起草单位：北京市水产技术推广站、北京出人境检验检疫局、全国水产技术推广总站、中国检 验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：潘勇、张利峰、李清、徐立蒲、江育林、余卫忠、张文、曹欢、王小亮、王姝、王静波、 那立海、贾丽。 行业标准信息服务平台 I SC/T7221—2016 蛙病毒检测方法 1范围 本标准规定了蛙病毒病病原的术语和定义、试剂和材料、仪器和设备、概述、分离、鉴定和综合判定。 本标准适用于蛙病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 蛙病毒 ranavirus 虹彩病毒科（Iridoviridae）蛙病毒属（Ranavirus）中除流行性造血器官坏死病毒（Epizootichaemato poieticnecrosisvirus，EHNV）和欧洲病毒（Europeancatfishvirus，ECV)外的其他成员。 3. 2 蛙病毒病infectionwithranavirus 蛙病毒属的多种病毒（不包括流行性造血器官坏死病毒和欧洲病毒）感染有尾和无尾目动物的 类系统性临床与亚临床感染 4试剂和材料 4.1蛙病毒参考株：由农业部指定的水生动物病原微生物菌（毒）种保藏机构提供。 鱼细胞系（BF-2）：采用M199培养液培养 4.3水：符合GB/T6682中一级水的要求。 4.4无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃ 4.5dNTP：含有浓度均为10mmol/L的dCTP、dGTP,dATP和dTTP.一20℃保存。 4.6Tag酶：10U/uL，一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。号 4.7引物：浓度为10μmol/L。序列如下： 上游引物F1:5'-CGC-AGT-CAA-GGC-CTT-GAT-GT-3'； 下游引物R1:5'-AAA-GAC-CCG-TTT-TGC-AGC-AAA-C-3'; 扩增蛙病毒主要衣壳蛋白基因中585bp的片段。 4.8MgCl2:25mmol/L。 4.9琼脂糖：电泳纯。 4.10矿物油：要求无DNA酶和RNA酶。 1 SC/T7221—2016 5仪器和设备 5.1解剖盘、剪刀、镊子、组织研磨器。 5.2倒置显微镜。 5.3生化培养箱。 5.4普通冰箱、超低温冰箱。 5.5低温离心机。 5.6超净台。 5.7PCR扩增仪。 5.8电泳仪。 5.9 凝胶成像系统或紫外观察灯 5.10 移液器、枪头、离心管和PCR 6 蛙病毒概述 根据OIE《水生动物 蛙病毒 lavirus) 毒科 ridoviridae)蛙 造血器宫外死病毒 virus,EHNV)和 matopoie cooh 外的其他成 镜DN 欧洲鲫病毒（Eur virus.EC 员。蛙病毒是大型的 病 ropea 毒，病毒粒子 直径150nm~1 170nm 面体对称，双链DNA染色体大小为150kb~170 抱核 和细胞质中 均能复制。代表种 是蛙病毒3型（Froy virus3FV3 ），其他还包括虎纹蝶螈病 na tigrinum Bohleiridoyrusr 桑蒂库珀蛙病毒（SanteeCo virus，ATV)、蛙虹 virusSTR) 等，并且毒株种类 7病毒的分离 7.1采样 取样数量按 7103的规定执行。 体长大 S 的大型两栖 物 长为30mm~60 并取所有内脏： 型两 动物，取躯干 体长小于3 和内脏。 7.2样品处理 应在10℃以下将样品 勺KMIS 1:10的最终稀释度重 液按 000IU/mL青霉 下孵育过夜。8000 r/min离心20min，收集上清液 7.3病毒接种与观察 对上清液10倍稀释两次，然后将这1 10.1：100和1:1 稀释度的上清液接种到生长约 后，加入细胞维持液，于22℃～25℃培养。分别设置2孔阳性对照（接种参考株）和空白对照（未接种病 毒的细胞） 对照和待测样品接种细胞7d内，每天用倒置显微镜检查。空白对照细胞应生长正常。被检样品 细胞培养中出现CPE时，应立即进行鉴定；如果只有阳性对照出现CPE，被检样品细胞培养中未出现 CPE时，培养7d后盲传一次，出现CPE进行鉴定，仍未出现CPE，判为阴性。 如果阳性对照细胞也未出现CPE，需要重新进行病毒学检查。 8病毒的鉴定 8.1样品处理 2 SC/T7221—2016 收集出现CPE的细胞病变悬液450μL，加人1.5mL的离心管，再加入450μLCTAB溶液（见 A.3)并混匀。25℃处理2h~2.5h。 8.2DNA抽提 在含有样品的离心管中加人600μL抽提液2（见A.5）.混合均匀至少30s。12000r/min离心5 min，取上层水相（约800μL）置于新的1.5mL离心管中。再加入700μL抽提液1（见A.4)，混合至少 30s。12000r/min离心5min，取上层水相（约600μL）置于新的1.5mL离心管中。再加人一20℃预冷 的1.5倍体积的无水乙醇（约900μL），倒置数次混匀后，一20℃沉淀核酸8h以上。12000r/min离心 30min，小心弃去上清液。干燥后加11L水溶解·用做PCR模板。 或采用同等功效的抽提试剂盒 8.3PCR扩增 依次加人以下试 剂：模板10g ，25mmoL/L的MgClz9μL， dNTP2μL，上游引物和下 Taq酶5U 如果使用的PCR扩增 仪没有热盖，每 还需 简低速离 油 再将反应管置于PCR 扩增仪上，94 预变 0次循环；72℃延伸15 nin min;4℃保温 8.4设立对照 程中必须设支阳性对照、 、阴性对照和空白对照 己知蛙病毒参考株的细 胞悬液或含有病毒国的 片段的标准质粒作为阳性对照，取正常的细胞悬 月性对照；取等体积的水 代替模板作为空自对 用TBE 电冰爱冲液（见A6）配置2%的琼脂糖（0.5ug/mLEB，见A 平板放人水平电 泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6L样品和2L样品缓冲液（见 加入样品孔。在 电泳时设立 ONA标准分子量做对照。I20V电泳约 在紫外灯下或 者凝胶成像 中观察 多核酸带并判断结果 8. 6 PCR 结果判定 阳性对照 ：阴性对照和空白对照 均无该条带 样品经P 现条带者，可判断为PCR阳性。 处出现 步鉴定到种，可以 NK）中公布的各种蚌痕 取PCR扩增产 GE 列进行比较，以进行蛙 病毒种类的鉴定 蛙病毒3 蛋白的参 考序列（585bp） 参见附 无条带出现或条带的大小不是 9综合判定 从样品中分离到病毒并经PC 有症状的样品经PCR直接检测结果为阳性者， 都可判定为蛙病毒阳性。通过测序并和基因库 GENBANK）中已知的各种蛙病毒DNA序列比较后能 进一步确认该病毒的种类。 3 SC/T7221—2016 附录A （规范性附录） 试剂及其配制 A.1细胞消化液(EDTA0.02%、胰酶0.06%PBS缓冲液） 在10L灭菌的去离子水中，顺序加人80gNaCl、2gKCl、1gKHzPO4、23gNazHPO,·12H2O。 用4g~6gNaHCO调节pH至7.4~8.0。然后加人2gEDTA，6g胰酶，完全溶解后过滤除菌，分装， 一20℃保存。 A.2细胞培养液 按M199培养液（含Earles盐）说明书的要求，用一级水配制，然后加人10%经56℃30min灭活 的胎牛血清，用NaHCO粉末调节培养液的pH为7.2～7.4。过滤除菌，分装后一20℃保存。在开放 系统使用时，需要加入过滤除菌的HEPES，使其在培养液中的终浓度为0.02mol/L。 A.3CTAB溶液 按CTAB2%,NaCl1.4mol/L,EDTA20mmoL/L,Tris-HCl20mmoL/L,pH=7.5配制。用前 加巯基乙醇至终浓度为0.25%。配制时，在60mL水中顺序加人8.19gNaCl、0.744gEDTA，1.21g Tris、0.25mL~0.3mL浓HCI，调整pH为7.5~8.0，再加人2gCTAB，搅拌待完全溶解后加水到100 mL。使用前，需加巯基乙醇至终浓度为0.25%。 A.4抽提液1 将氯仿：异戊醇按24：1的比例混合，密闭避光保存 A.5抽提液2 酚（1moL/LTris饱和）：氯仿：异戊醇=25：24：1混合，密闭避光保存。 A.6TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液） 在1000mL水中，分别加人54gTris、27.5g硼酸2.922gEDTA，用5mol/L的HCl调pH到 8.0。 A.7EB(ethidiumBromide，核酸染色剂） 用水配制成10mg/mL的浓缩液。避光保存。用时在每10mL电泳液或琼脂中加1uL。 A.8样品缓冲液 每100mL水溶液中含溴酚蓝