SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 0973—2010 代替SN/T0973—2000 进出口肉、肉制品及其他食品 中肠出血性大肠杆菌 O157：H7检测方法 Determination of entero-hemorrhagic E. coli O157:H7 in meats/meat product and other food for import and export 业标准信息服务平台 2010-11-01发布 2011-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T0973—2010 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T0973一2000《进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌O157：H7检测方法》。 本标准与SN/T0973一2000相比，主要技术变化如下： 补充了ELISA方法快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的内容； 补充了微生物遗传分子特征性鉴定技术（基因分型）内容，便于对该危害性致病菌的溯源性调 查和变异性研究。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫 局、3M中国有限公司、生物梅里埃（中国）公司。 本标准主要起草人：张树宏、顾鸣、韩伟、杨捷琳、范放、吕敬章、万志刚、吕雷、朱华、刘毅。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T0973—2000。 行业标准信息服务平台 I SN/T 0973—2010 进出口肉、肉制品及其他食品 中肠出血性大肠杆菌 O157:H7检测方法 1范围 本标准规定了进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌O157：H7的检测方法。 本标准适用于进出口肉、肉制品及其他食品中的肠出血性大肠杆菌O157：H7的定性检验。 2定义和术语 下列术语和定义适用于本文件。 2. 1 肠出血性大肠杆菌0157：H7entero-hemorrhagicE.Coli0157：H7 本细菌为需氧或兼性厌氧、革兰氏阴性，有周鞭毛，并有菌毛，不产生芽孢，发酵乳糖，不发酵或迟缓 发酵山梨醇，氧化酶阴性，β葡萄糖苷酶阴性的杆菌。 3方法原理 采用Tecra微孔板法大肠杆菌Q157：H7快速检测试剂盒方法"。样品增菌液煮沸裂解，裂解液与 标准信息服务平台 物，利用肉眼或酶标仪进行检测。 4设备和材料 4.1恒温培养箱：（10℃~50℃）±1℃。 4.2均质器：小于12000r/min。 4.3 高压灭菌锅。 4.4 科玛嘉大肠杆菌O157：H7显色琼脂平板²。 4. 5 VIDAS自动酶联免疫检测仪，法国梅利埃公司产品或其他等效产品。 4.6 VITEK自动微生物生化鉴定仪或其他等效产品3。 4.7 微生物实验室通用玻璃器血、移液管、玻皿等。 4.8 铂铱或镍铬丝接种环，直径约3mm；玻璃L棒。 1）、2）分别为由美国3M公司和法国科玛嘉公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用 者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 3）由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品 的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 1 SN/T 0973—2010 4.9电子天平：精确值0.001g。 4.10移液枪及枪头：1mL、0.2mL。 4.11洗板机。 4.12酉 酶标仪（波长450nm）。 5培养基和试剂 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水（Tecra法试剂的配制使用重蒸水）。 5.1改良E.C新生霉素增菌肉汤[m(EC)n]:见附录A中A.1。 5.2山梨醇麦康凯琼脂（SMAC)：见附录A中A.2。 5.3月桂基磷酸盐胰蛋白陈MUG肉汤(LST-MUG):见附录A中A.3。 等效产品。 5.5含新生霉素的缓冲胰蛋白陈大豆肉汤(BTSB+N）：见附录A中A.4。 5.6Imbentin补充液：见附录A中A.5。 6 试样制备与保存 6.1制备 从混合样品中取出代表性样品，将可食用部分（去掉可见脂肪）充分均质。用四分法所分出不少于 500g作为试样，装人灭菌容器内，加封后标明标记。 行业标准信息服务平台 6.2保存 试样于一18℃以下冷冻保存 7木 检测流程 检测流程见图1。 2 SN/T0973—2010 检样25g 225mLm(EC)n肉汤 41℃±1℃,18h~24h 10~410-5、10-6三个稀释度0.1mL，分别涂布SMA ELISA方法 平板和科玛嘉显色琼脂平板，36℃土1℃下培养 或VIDAS仪等 18h~24h，每个平板挑5个~8个无色菌落 快速筛选 接种LST-MUG发醇管培养基36℃C土1℃下 培养24h。挑产气且无荧光培养物转种普通营养 阴性样 阳性样 品，报告 品，进一 未检出 步鉴定 无可疑菌落 可疑菌落，纯化 报告未检出 作进一步鉴定 生化鉴定 血清凝集 VITEK仪等 鉴定 报告结果 图1大肠杆菌0157:H7的检测流程 准信息服务 检测步骤 8.1常规方法 8.1.1增菌 无菌操作称取6.1的试样25g放人含225mLm（EC)n增菌肉汤的均质容器中，置41℃士1℃培 养18 h~24 h。 8.1.2分离 对8.1.1增菌肉汤进行10倍递增稀释，从10-4，10-5、10-6稀释液中各取0.1mL滴加于SMAC 平板或（和）科玛嘉大肠杆菌显色琼脂平板上，以灭菌L棒进行涂布并置于36℃土1℃培养18h～ 大肠杆菌显色琼脂平板上可疑EHEC菌落呈紫红色。 8.1.3生化试验和血清学鉴定 每个SMAC平板或科玛嘉大肠杆菌显色琼脂平板上要求挑选不少于5个～8个可疑菌落，然后将 3 SN/T 0973—2010 挑出的每个菌落接种到LST-MUG肉汤中，36℃土1℃培养24h，出现产气，并且无荧光者，于普通营 养琼脂进行纯化，并对单菌落参见附录B进行生化鉴定，或采用VITEK或等效的自动微生物生化鉴定 仪进行鉴定，然后用O157：H7标准血清做凝集试验。最后，也可见附录C采用遗传分子特征性鉴定试 验进行鉴定。 8.1.4结果报告 根据选择性分离平板、生化试验和血清学鉴定结果，分别报告25g样品中检出或未检出肠出血性 大肠杆菌O157:H7。 8.2TecraTM微孔板法大肠杆菌0157:H7快速检测试剂盒方法 8.2.1增菌 8.2.1.1熟肉制品 同8.1.1 8.2.1.2生肉制品 无菌操作称取6.1的试样25g放人含225mLm（EC）n增菌肉汤的500mL灭菌光口瓶中，然后 再添加2.25mL的Imbentin补充液，置41℃士1℃培养18h24h。 8.2.1.3其他食品 1 ℃培养18 h~24 h。 8.2.2Tecra试剂盒检测 8.2.2.1检测前,将TecraELISA试剂盒置室温(20℃～25℃)10 min。 菌到同一试管内，充分混合。 8.2.2.3进行热处理，在沸水浴中将试管加热15min后，将试管冷却到室温。 30min。吸取每个样品时需换用新的移液器吸头。 8.2.2.5倾除检测板微孔中的溶液，用洗液充满每个微孔，注意不要将气泡滞留于孔板底部、洗涤检板 3次。 8. 2.2.7 按8.2.2.5冲洗检测板微孔4次。 8.2.2.8每个微孔加入200uL的底物，置于室温20℃~25℃，放置15min。 8.2.2.9每个微孔添加20μL终止液。轻敲孔板边缘以混合内容物，然后在30min内判读结果。 8.2.2.10结果可依据试剂盒说明用肉眼判读或用酶标仪判读。酶标仪判读时，阴性对照孔OD值应 <0.2,阳性对照孔OD值应>1.0。如果阳性对照OD值<1.0时，需要延长显色时间；30min后，如果 阳性对照孔OD值仍然<1.0.即本次检测结果无效。样品孔OD值<0.2时判为阴性，≥0.2时判为 阳性。 8.2.3阳性结果的鉴定 出现阳性结果时，在SMAC平板和科玛嘉大肠杆菌显色琼脂平板上对原增菌肉汤进行培养分离， 4 SN/T0973—2010 若有可疑菌落生长，依据8.1.3进行鉴定。 8.2.4结果报告 8.2.4.1若试剂盒检测结果为阴性，报告25g样品中未检出肠出血性大肠杆菌O157：H7。 品中检出或未检出肠出血性大肠杆菌O157：H7。 8.3VIDAS仪器法大肠杆菌O157:H7的快速筛选检测方法 8.3.1增菌 同8.1.1 8.3.2自动酶联免疫检测 8.3.2.1取1mL增菌液到灭菌小试管中，于沸水中加热15min。剩余的菌液于40℃保存，以便用于 阳性确认。 8.3.2.2取肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7的荧光免疫试剂盒，室温放置至少30min，使试剂温度 平衡至环境温度。 8.3.2.3取适量加热处理并冷却后的增菌液到试剂盒测试孔中，通过自动或手动操作免疫反应过程 后，检测反应强度（荧光强度或吸光度），与参照值比较，得出检验结果。详细操作需根据所用仪器及试 剂盒的说明进行。 8.3.3阳性结果的鉴定 出现阳性结果时，在SMAC平板和科玛嘉大肠杆菌显色琼脂平板上对原增菌肉汤进行分离培养， 若有可疑菌落生长，依据8.1.3进行鉴定。 8.3.4结果报告 8.3.4.1若VIDAS检测结果为阴性，报告25g样品中未检出肠出血性大肠杆菌O157:H7。 8.3.4.2若VIDAS检测结果为阳性，则根据分离纯化及生化试验和血清学鉴定结果，分别报告25g 信息服务平台 5