ICS 11. 020 SN CCS C 62 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3306.162021 国境口岸环介导恒温扩增（LAMP） 检测方法 第16部分：寨卡病毒 Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port Part16:Zika Virus 2021-06-18发布 2022-01-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T3306.16—2021 前言 规定起草。 本文件是SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法》的第16部分。SN/T3306已 经发布了以下部分： 第1部分：鼠疫杆菌； 第2部分：产毒素霍乱弧菌； 第3部分：志贺氏菌； 第4部分：嗜肺军团菌； 第5部分：布鲁氏菌； 第6部分：黄热病毒； 第7部分：猴痘病毒； 第8部分：基孔肯雅病毒； 第9部分：结核分枝杆菌； 第10部分：炭疽芽孢杆菌； 第11部分：副溶血性弧菌； 第12部分：空肠弯曲菌； 第13部分：症原虫； 第14部分：大肠杆菌0157:H7 出版文本为准 第15部分：沙门氏菌； 第16部分：寨卡病毒。 第17部分：包虫。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：烟台国际旅行卫生保健中心、天津国际旅行卫生保健中心、中国科学检验检 疫科学研究院、甘肃国际旅行卫生保健中心、北京蓝谱生物科技有限公司。 本文件主要起草人：钟响、刘宁、高娟娟、左锋、韩辉、刘鹏、王颖、方绍庆、王莉、米佳。 准信息服务平台 I SN/T3306.16—2021 国境口岸环介导恒温扩增（LAMP） 检测方法 第16部分：寨卡病毒 1范围 本文件规定了国境口岸寨卡病毒的环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 本文件适用于国境口岸出人境人员血液、尿液、唾液等及埃及伊蚊、白蚊伊蚊携带寨卡病毒的 筛查检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 租用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要素 SN/T4652.2国境口岸寨卡病毒病防控技术规范第2部分：标本采集和处理方式 SN/T4652.3国境口岸寨卡病毒病防控技术规范第3部分：实验室检测 病原微生物实验室生物安全管理条例（中华人民共和国国务院令第424号） 3缩略语 代出版 下列缩略语适用于本文件。 RNA：核糖核酸（ribonucleicacid） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） dNTP：脱氧核节三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetra acetic acid） LAMP：环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermal amplification） 4生物安全措施及防污染措施 寨卡病毒在我国归属于三类病原微生物，应在生物安全二级实验室（BSL-2）开展实验室检测 应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》等相关规定要求，做好生物安全防护工作。 LAMP扩增灵敏度高使得其更容易污染导致假阳性，因此应高度重视扩增产物的污染问题，反应 过程中和反应完成后应避免开盖。加样过程应在生物安全柜进行，加样顺序为：阴性对照、样本、阳 性对照，切勿打乱顺序，否则易出现假阳性。废弃物处理应符合GB19489中的规定。 5技术概要 根据寨卡病毒的NS5基因序列设计内、外引物及环状引物，识别靶序列上的8个独立区域，利用 BstDNA聚合酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而 复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物，同时从dNTP析出大量焦磷酸根离子。添加的 1 SN/T3306.16-2021 钙黄绿素显色剂初始与锰离子结合处于荧光淬灭状态，随着反应的进行，焦磷酸根离子夺去结合的锰 离子，钙黄绿素恢复从而发出绿色荧光，进而与反应液中的镁离子结合使荧光增强。 6试剂和材料 6.1引物：根据寨卡病毒特有的NS5基因（见附录A）设计一套特异性引物、包括外引物1、外引物 2、内引物1、内引物2和环状引物1、环状引物2。 外引物1（F3，5-3）：GCAGAGCAATGGATGGGATA 外引物2（B3，5-3’）：CCCATCCTTGAGGTACAGCT 内引物1（FIP，5'-3)：AAGAACCTGAGGGCATGTGCAAGACTCAAACGAATGGCGGT 内引物2（BIP，5’-3’)：CACAGGAGTGGAAACCCTCGACTGAAGTGGTGGGAGCAGA 环状引物1（LF，5’-3’）：CACAACGCAGTCATCTCCAC 环状引物2（LB，5’-3'）：TGGAGCAATTGGGAAGAAGTCC 6.2核算提取试剂盒：QIAampViralRNAKit或市售等效产品。 6.3BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶：均为8U/μL。 6.42×ThermoPol缓冲液：含40mmol/LTris-HCl（pH8.8）、20mmol/L（NH）2SO4、20mmol/LKCl、 16mmol/LMgS04、0.2%Tween20、1.6mol/L甜菜碱、dNTPs每种浓度2.8mmol/L 6.5钙黄绿素。 6.70.2mL和1.5mL塑料离心管。 6.8吸头，配套移液器使用。 7 仪器和设备 出版文 7.1移液器：量程0.1μL~2μL，量程0.5μL~10μL，量程10μL~100μL，量程100μL~1000μL。 7.2高速台式离心机：≥7000g。 7.3水浴锅或加热模块：65℃±1℃和95℃±1℃。 7.4组织研磨器。 7.5紫外线照射装置：波长240nm~260mm，350mm~370m。 业标准信息服务平台 7.6计时器。 8 检测程序 寨卡病毒检测程序见图1。 9操作步骤 9.1样本的采集、保存和运输 样本采集、保存和运输按照SN/T4652.2确定的执行。 1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其它等效产品具有相同 的效果，则可使用这些等效产品。 2 SN/T 3306.16—2021 待测样品 样品前处理 A 模板RNA提取 LAMP反应 阴性 阳性 结果报告 图1 9.2 模板RNA提取 从血液、尿液、唾液样本或蚊虫样本中提取RNA采用6.2所示病毒RNA提取试剂盒或采用市售等 效产品，详见试剂盒说明书。 9.3LAMP检测 9.3.1 反应体系 式出版 寨卡病毒的环介导引物恒温扩增反应体系见表1. 表1 寨卡病毒环介导引物恒温扩增反应体系 试剂名称 储备液浓度 体系加样/L 2×ThermoPol缓冲液 12.5 F3引物 5 pmol 0.1 B3引物 5 pmol FIP引物 40 pmol 0.8 BIP引物 40 pmol 0.8 LF引物 20 pmol 0.4 LB引物 20 pmol 0.4 BstDNA聚合酶 8 U/μL AMV逆转录酶 8 U/μL 1 模板 2 ddH,0 5.9 总体积 25 3