SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3929—2014 出口食品中L-羟脯氨酸的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of L-hydroxyproline in foodstuffs for export- LC-MS/MS method 行业标准信息服务平台 2014-04-09发布 2014-11-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3929—2014 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任， 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共 和国北京出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：彭涛、邓晓军、朱爱玲、赵善贞、李晓娟、王金花、范春林、陈颖。 行业标准信息服务平台 I SN/T 3929—2014 出口食品中L-羟脯氨酸的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本标准规定了出口食品中L-羟脯氨酸的制样和液相色谱-质谱/质谱测定方法。 本标准适用于液态奶、奶粉、黄油、酸奶、奶油、奶酪、巧克力、奶饮料等乳及乳制品，蛋白粉等植物源 性食品中L-羟脯氨酸的液相色谱-质谱/质谱测定 2方法提要 用液相色谱-质谱/质谱测定，内标法定量。 3试剂和材料 除非另有规定，均使用分析纯试剂，水为去离子水。 3.1乙腈：液相色谱级。 3.2甲酸：液相色谱级。 3.3甲酸铵：液相色谱级。 3.4正已烷：液相色谱级。 3.5盐酸：分析纯，浓度为12mol/L。 3.6乙睛饱和正已烷：取100mL正已烷（3.4），加人50mL乙睛（3.1），振摇混匀后，静置分层，上层液 备用。 3.76mol/L盐酸溶液：取50mL盐酸（3.5）于100mL容量瓶，用水定容至100mL，备用。 3.8流动相A：精确称取0.158g甲酸铵（3.3）于400mL水中，加人1mL甲酸（3.2），用水定容至 500mL，备用。 3.9流动相B：准确量取流动相A（3.8）25mL，加入乙睛475mL混匀，备用。 3.10标准物质：L-羟脯氨酸（L-Hydroxyproline，CAS号：51-35-4，纯度大于99%）；3，4-脱氢-脯氨酸 （3，4-Didehydro-L-proline，CAS号：4043-88-3，纯度大于99%）。 3.11标准储备溶液：精确称取L-羟脯氨酸（3.10）10mg（精确到0.01mg），用水溶解并定容于10mL 棕色容量瓶中，配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备溶液。0℃～4℃避光保存。 3.12内标储备溶液：精确称取3,4-脱氢-脯氨酸的标准物质（3.10)10mg（精确到0.01mg），用水溶解 并定容于10mL棕色容量瓶中，配制成浓度为1.0mg/mL的内标储备溶液。0℃～4℃避光保存。 3.13标准中间溶液：精确量取标准储备溶液（3.11)1mL，用水稀释并定容于10mL棕色容量瓶中，配 制成浓度为100ug/mL的标准中间溶液。0℃～4℃避光保存。 3.14内标溶液：精确量取内标储备溶液（3.12)1mL，用水稀释并定容于10mL棕色容量瓶中，配制成 浓度为100μg/mL的内标溶液。0℃～4℃避光保存。 3.15海砂：化学纯，粒度0.65mm~0.85mm，SiO2含量为99%。 3.16石墨化碳：SampliQcarbonSPEBulkSorbent，或相当者。 1 SN/T3929—2014 3.17微孔滤膜：0.22μm，有机相。 4仪器和设备 4.1液相色谱-质谱/质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI)。 4.2分析天平：感量0.0001g和0.01mg。 4.3冷冻干燥机：冷阱温度≤一80℃。 旋涡混匀器。 4.5 旋转蒸发仪。 4.6 超声清洗器。 4.7研钵。 4.8 水解管：30mL。 4.9 滤纸：定性滤纸，直径为12.5cm。 5试样制备与保存 5.1从所取全部试样中取出有均匀性的代表性试样约500g，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于 0℃~4℃冷藏存放。 5.2在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生分析物含量的变化。 6测定步骤 6.1提取 6.1.1奶粉、蛋白粉 称取试样0.5g士0.05g于30mL水解管中，依次加入40μL内标溶液（3.14），10mL6mol/L盐酸 溶液（3.7），涡旋混合2min后，充人氮气密封，于105℃下过夜水解。冷却至室温后，滤纸过滤，滤液定 容至10mL，分取2.5mL，用水稀释至25mL，一80℃冷冻干燥2h以上。冻干物依次加入1mL水、 50mg石墨化碳（3.16）和10mL乙溶解，涡旋1min，超声5min后，滤纸过滤，再用10mL乙睛重复 提取2次，合并滤液。滤液于40℃减压浓缩至干，用1mL乙睛-水（9十1，体积比）溶解，待净化。 6.1.2液态奶、奶饮料、酸奶、奶油 称取试样1.0g士0.05g于30mL水解管中，加入40μL内标溶液（3.14），余下操作按6.1.1方法处 理样品。 6.1.3黄油、奶酪、巧克力 称取试样1.0g土0.05g于研钵中，加入试样质量4～6倍的海砂（3.15）研磨成干粉状，转移至 30mL水解管中，余下操作按6.1.1方法处理样品。 6.2净化 相色谱-质谱/质谱仪测定。 2 SN/T 3929—2014 6.3测定 6.3.1 高效液相色谱条件 高效液相色谱条件如下： 色谱柱：AgilentHILICPLUS，长100mm，内径2.1mm，粒径3.5μm，或相当者。 b) 流动相：梯度洗脱程序见表1。 c) 流速：0.4mL/min。 d) 进样量：10μL。 e) 柱温：室温。 表1梯度洗脱程序表 时间/min 流动相A/% 流动相B/% 0 10 06 2.0 10 90 4.0 20 80 5.0 20 80 7.0 50 50 8.0 50 50 8.1 10 90 6.3.2 质谱条件 参见附录A。 6.3.3 内标曲线的绘制 取5个30mL水解管，各加人40μL内标溶液（3.14），再按照5个浓度水平，分别加1μL、 照6.1、6.2步骤进行。用LC-MS/MS分析测定，以加入L-羟脯氨酸标准品绝对量为横坐标，L-羟脯氨 酸定量离子对峰面积/内标定量离子对峰面积比值为纵坐标，绘制内标曲线。 6.3.4定量测定 采用内标曲线法定量。标准工作液和待测液中分析物的响应值均应在仪器线性响应范围内。如果 L-羟脯氨酸、3,4-脱羟脯氨酸的参考保留时间分别为5.1min和4.1min,L羟脯氨酸、3,4-脱氢-脯氨酸 的多反应监测质量色谱图参见附录B。 结果计算和表述 按式（1)计算试样中L-羟脯氨酸的含量，计算结果需扣除空白值： 1000 mo X: (1) mi 1000 3 SN/T 3929—2014 式中： 一试样中L-羟脯氨酸的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； X 内标曲线上对应L-羟脯氨酸的质量，单位为微克（ug）； mo 称样量，单位为克（g)。 mr- 一 定量限和回收率 8.1定量限(L0Q) 液态奶、奶饮料、黄油为0.25mg/kg；奶油为1mg/kg；奶粉、蛋白粉为1.5mg/kg；奶酪为2mg/kg； 巧克力为3mg/kg；酸奶为5mg/kg。 8.2 回收率 本标准的回收率和相对标准偏差参见附录C。 行业标准信息服务平台 SN/T 3929—2014 附录A （资料性附录） 质谱条件1) 表 A,1 质谱条件 离子源 电喷雾电离 扫描方式 正离子模式 监测方式 多反应监测 毛细管电压 4.0kv 干燥气温度 350 ℃ 干燥气流速 9 L/min 喷雾气压力 氮气，50psi 表 A.2 多反应监测条件 母离子 子离子 传输电压 碰撞电压 化合物 (m /z) (m/ z) V V 68.1° 80 50 L-羟脯氨酸 132.1 86.1 80 15 3,4-脱氢-脯氨酸 114 68.1* 50 15 为定量离子对。 行业标准信息服务平台 1) 附录A所列参数是在AgilentLC/MSQQQ6410质谱仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提供 参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试采用不同厂家或型号的仪器。 5