SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3994—2014 动物产品中肠出血性大肠杆菌 O104：H4检疫技术规范 Quarantine protocol for Enterohemorrhagic Escherichia coli O104 : H4 in animal product 行业标准信息服务平台 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3994—2014 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民 共和国天津出入境检验检疫局 本标准主要起草人：杨俊兴、陶虹、唐金明、花群义、阮周曦、吕建强、林庆燕、王玉玲、曹琛福、谢晓露、 刘建利、廖立珊。 行业标准信息服务平台 1 SN/T3994—2014 动物产品中肠出血性大肠杆菌 0104：H4检疫技术规范 1范围 本标准规定了动物产品中肠出血性大肠杆菌（EnterohemorrhagicEscherichiacoli，EHEC） O104：H4的检疫技术规范。 本标准适用于动物产品中的EHECO104：H4的检测。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp:碱基对 BPW：缓冲蛋白陈水 CT-SMAC:改良山梨醇麦康凯培养基 DNA:脱氧核糖核酸 dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸 E.coli：大肠杆菌V 标准信息服务平台 EHEC:肠出血性大肠杆菌 ELISA：酶联免疫吸附试验 mTSB：改良胰蛋白陈大豆肉汤 PBS:磷酸缓冲液 PCR：聚合酶链式反应 SMAC：山梨醇麦康凯培养基 4设备与材料 4.1主要仪器设备 4.1.1恒温培养箱。 4.1.2均质器：2000r/min~12000r/min。 4.1.3高压灭菌锅。 4.1.4电子天平：精确值0.0001g。 1 SN/T 3994—2014 4.1.5 冷冻离心机。 4.1.6 全自动微生物及药敏分析系统。 4.1.7 生物显微镜， 4.1.8 普通PCR仪。 4.1.9 荧光PCR仪。 4.1.10 电泳分析仪。 4.1.11 水平电泳槽。 4.1.12 pH计。 4.1.13 ELISA洗板机：96孔（8×12）。 4.1.14 酶标仪：适用于96孔（8×12）ELISA板检测，可满足波长450nm使用。 4.2 培养基与试剂 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，用于PCR的试剂均用无DNA酶污染的容器分装。所 有实验用水均为灭菌双蒸水，应符合GB/T6682中一级水要求。 4.2.1 缓冲蛋白陈水（BPW）：配方见附录A。 4.2.2 改良胰蛋白陈大豆肉汤（mTSB）：配方见附录A。 4.2.3 新生霉素（Novobiocin）。 4.2.4 丝裂霉素C(MitomycinC)。 4.2.5 改良山梨醇麦康凯（CT-SMAC)琼脂：配方见附录A。 4.2.6 改良科玛嘉显色琼脂。 4.2.7 革兰氏染色液：配方见附录A。 4.2.8 荧光PCR试剂盒。 4.2.9 PCR试剂盒。 4.2.10 大肠杆菌诊断血清（包括O104诊断血清及H4诊断血清）。 行业标准信息服务平台 5 操作步骤 5.1 1检测流程 见图1。 2 SN/T3994—2014 25g+225mLBPW,均质 检样25g 36℃±1℃:18h~24h DNA制备 实时荧光PCR检测stx2基因 阴性 阳性 25mL+225mL含新生霉素mTSB 36℃±1℃;6h~8h 1mL+4mL含丝裂霉素的mTSB 36℃±1℃;16h~18h 或 ELISA检测志贺样毒素 阴性 阳性 行业标 CT-SMAC平板和改良科玛嘉显色琼脂平板 36℃±1℃;18h~24h 挑4~6个可疑菌落 生化试验 PCR检测wzy、flic基因 O104、H4血清型鉴定 务平台 报告未检出 报告 图 1 检测流程图 5.2试样制备 从混合样品中取出代表性样品，如含有脂肪则需先去除脂肪，用均质器将样品充分均质。用四分法 分出不少于500g作为试样，装人灭菌容器内，加封后作好标记。样品采集后应尽快检测，若不能及时 检测，可在2℃~4℃保存18h。 3 SN/T3994—2014 5.3前增菌 称取5.2中制备的样品25g放人盛有225mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min10000r/min 均质1min~2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min。无 菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃土1℃培养18h24h。 5.4实时荧光PCR检测stx2基因 5.4.1stx2特异性引物和探针序列 stx2特异性引物和探针序列是： 上游引物：5'-TGCTGTCCGTTGTCATGGA-3" 下游引I物：:5’-GGGTTCGTTAATACGGCAAC-3 探针:FAM-5'-ACCGTTGTCACACCGGGCACTGATA-3'-TAMRA 5.4.2细菌DNA的制备 取5.3中培养的增菌液1mL，加人1.5mL无菌离心管中，5000r/min离心5min，弃上清液；加人 100μL灭菌水，重悬沉淀后，沸水浴煮沸5min，冰浴3min，12000r/min离心5min，取上清液立即进 行检测或于一20℃保存备用。细菌DNA的制备也可使用等效商品化DNA提取试剂盒。 5.4.3实时荧光PCR反应体系 反应体系体积为25μL，组分如下： 10XPCR缓冲液 2.5 μL 上下游引物（10μmol/L) 1 μL 上下游引物（10μmol/L） 1 μL 探针(10μmol/L) 0.5 μL dNTP(10 mmol/L) 2 μL DNA模板 3 μL TaqDNA聚合酶 0.5 μL 水 14.5 μL 或按商品化试剂盒推荐体系配制。 5.4.4实时荧光PCR反应程序 实时荧光PCR反应程序步骤如下： a）第一步:95℃3min; 教务平台 第二步：95℃5s，60℃40s40个循环，60℃时收集相应荧光信号 b) 或按商品化试剂盒推荐反应程序进行。 5.4.5荧光PCR反应结果及判断 5.4.5.1 质控标准 5.4.5.1.1 阴性对照：无扩增曲线，Ct值≥40。 5.4.5.1.2阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct值<30.0。 5.4.5.2 结果判定和报告 5.4.5.2.1 Ct值≥40，可判定样品结果为stx2阴性，可直接报告EHECO104：H4未检出。 4 SN/T3994—2014 5.4.5.2.2Ct值≤35.0，可判定该样品结果为stx2阳性。 对于荧光PCR法检测stx2阳性的样品，应进行以下确认实验。 5.5增菌 轻轻振荡培养过的样品混合物，取25mL加入225mL预热至37℃含新生霉素（终浓度为10mg/L） 的mTSB培养基中，37℃振荡培养（180r/min～220r/min)6h～8h。取1mL经mTSB培养基培养 的混合物加入4mL含丝裂霉素（终浓度为50uμg/L）的mTSB培养基中，37℃振荡培养（180r/min~ 220 r/min)16 h~18 h。 5.6志贺样毒素检测 5000r/min离心10min，取100μL上清液，用商品化ELISA试剂盒检测产志贺样毒素（I型和ⅡI型）， 具体操作按ELISA试剂盒说明书进行。 5.7分离培养 分别用接种环取少许5.5中的增菌液，划线接种于一个山梨醇麦康凯琼脂平板（SMAC)和一个科 玛嘉显色琼脂平板，于36℃土1℃培养18h～24h，观察平板上生长的菌落，显色培养基平板的典型菌 落按显色培养基说明进行判定。从选择性琼脂平板上分别挑取4～6个典型或可疑菌落，接种营养琼脂 平板，于36℃±1℃培养18h~24h。 5.8革兰氏染色和显微镜观察 5.8.1涂片：取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环取少许培养物，与蒸馏水混合后 均匀地涂抹于载玻片表面，并作好记号。 5.8.2干燥：室温自然干燥。 5.8.3固定：固定时通过火焰2～3次即可，以载玻片背面不烫手为宜。 5.8.4染色：按常规方法进行初染、媒染、脱色和复染。 5.8.5 镜检：室温干燥后，置油镜下观察（革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色）。 5.9 生化试验 5.9.1参考附录B中EHECO104：H4生化特性，随机挑取4～6个可疑菌落，进行生化试验。 5.9.2也可用商品化试剂盒进行生化试验如用Vitek2GN测试卡，按照相应说明书进行操作。 5.10聚合酶链式反应（PCR) 易服 5.10.1检测 5.10.2 2细菌DNA的制备 见5.4.2。 5.10.3PCR反应体系 按以下反应体系配制，或按商品化试剂盒说明书进行配制： 10XPCR缓冲液 2.5 μL P1(10 μmol/L) 1 μL 5