SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1129—2015 代替SN/T1129—2007,SN/T1905—2007 牛病毒性腹泻/黏膜病检疫技术规范 Quarantine protocol for bovine viral diarrhea/mucosal disease 行业标准信息服务平台 2015-09-02发布 2016-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 行业 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 牛病毒性腹泻/黏膜病检疫技术规范 SN/T 1129-2015 中国标准出版社出版 务平台 北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029） 北京市西城区三里河北街16号（100045） 总编室：（010)68533533 网址www.spc.net.cn 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×1230 1/16 印张 1 字数26千字 2016年3月第一版 2016年3月第一次印刷 印数1-1100 * 书号：155066·2-29873 定价18.00元 SN/T1129—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1129—2007《牛病毒性腹泻/粘膜病检疫规范》和SN/T1905—2007《牛病毒性 腹泻/粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程》。 本标准与所代替标准的主要技术差异如下： 整合了SN/T1129—2007和SN/T1905—2007内容； 按OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2008版）修改了试验方法。 本标准修改采用了世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（Manualof Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals)(2008 版)中 2.4.8。 本标准与OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》2.4.8相比，主要技术异同如下： 本标准采用了OIE规定的病毒分离与鉴定、荧光抗体试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验、微 量血清中和试验及酶联免疫吸附试验方法： 本标准增加了OIE中提及但没有详细操作规程的反转录聚合酶链式反应具体试验方法。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫 局、中华人民共和国四川出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：白泉阳、孙颖杰、王伟利、王武军、孟庆峰、张体银、石建平、孟日增、张伯强、 刘金华。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1129.1—2002; SN/T1129.2—2002; SN/T1129—2007; —SN/T19052007。 业标准信息服务平台 1 SN/T 1129—2015 牛病毒性腹泻/黏膜病检疫技术规范 1范围 本标准规定了牛病毒性腹泻/黏膜病的临床诊断、病毒分离鉴定、荧光抗体试验、免疫过氧化物酶单 层细胞试验、微量血清中和试验、抗原捕获酶联免疫吸附试验、反转录-聚合酶链反应操作规程。 本标准适用于进出口动物及其产品中牛病毒性腹泻/黏膜病的检疫。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 符号和缩略语 3 BVD：牛病毒性腹泻/黏膜病 BVDV:牛病毒性腹泻/黏膜病病毒 PBS:磷酸缓冲盐溶液 MEM:最低基础培养基 MDBK：牛肾传代细胞 DEPC：焦碳酸乙二酯 TCIDso：半数组织培养感染量 标准信息服务 RNA:核糖核酸 Taq酶：TaqDNA聚合酶 RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应 4临床诊断 4.1 临床症状 BVD潜伏期为7d～14d。急性病牛主要表现为突然发病，体温升高，重度腹泻，白细胞减少，大量 流涎，口腔黏膜糜烂和溃疡，可在发病后几天死亡。慢性病例临床症状不明显或逐渐发病，生长发育受 阻，消瘦，体重逐渐下降，比较特殊的症状是鼻镜上的糜烂，糜烂可在鼻镜上连成一片，表现为间歇性腹 泻，病程较长，可在发病数周或数月后死亡。 4.2病理变化 消化道黏膜充血、出血、水肿和糜烂。特征性病变是食道黏膜糜烂，呈大小和形态不一的直线排列。 瘤胃黏膜出血、糜烂，第四胃炎性水肿、糜烂。小肠呈急性卡他性炎症，肠壁水肿增厚，大肠呈卡他性、出 1 SN/T1129—2015 血性、溃疡性以至坏死性炎症。在流产胎儿的口腔、食道、真胃及气管内可见出血斑和溃疡。 5病毒分离与鉴定 5.1 主要仪器设备 5.1.1 倒置显微镜。 5.1.2恒温培养箱。 5.1.3 单道可调移液器。 5.2试剂和材料 5.2.1 本标准所用试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682要求。 5.2.212.5cm²细胞培养瓶。 5.2.3无BVDV抗体胎牛血清。 5.2.4 培养液：MEM营养液、生长液、维持液，配制方法见附录A中A.1～A.3 5.2.5 PBS:磷酸盐缓冲液（0.01mol/L、pH7.2,PBS)，配制方法见A.4。 5.2.6 细胞分散液：0.25%胰蛋白酶，配制方法见A.5。 5.2.7 无BVDV感染的新生特牛原代肾细胞或原代睾丸细胞，按常规胰酶消化方法制备。 5.3 样品的采集 5.3.1 对于牛群、种公牛的检疫，无菌采血液或精液。 5.3.2 对怀疑为急性感染期或持续感染的牛，采取血液或鼻腔分泌物。 5.3.3 对流产、死胎，采取胎儿组织。 5.3.4对怀疑死于黏膜病的牛，可采集血块和各组织，尤其是肠道集合淋巴组织。如果肠道样品已经 发生自溶，可采集扁桃体或淋巴结。 5.4样品的处理 5.4.1 血液按常规方法分离血清 5.4.2精液冻融3次后，PBS作1：10稀释，3000r/min离心10min，取上清液。 5.4.3动物组织加10倍体积含有青霉素1000IU/mL，链霉素1000μg/mL的PBS研磨，3000r/min 离心10min，取上清液。 5.5样品的接种培养 5.5.1取生长良好，形成80%以上单层的原代细胞培养瓶，弃去生长液，用PBS洗涤1次，接种处理好 的样品，每瓶接种1mL，每个样品接种3个细胞瓶，同时以PBS作为阴性对照，置37℃吸附1h。 5.5.2弃去培养瓶内液体，加人维持液，置37℃培养，逐日观察CPE，待50%以上细胞出现CPE时收 获培养物，如不出现CPE，第6天收获培养物。 5.5.3将收获的培养物冻融3次，同一样品3瓶混合即为样品病毒分离培养物，冷冻保存，用于病毒 鉴定。 5.6病毒鉴定 病毒鉴定选择本标准中提供的竞争法荧光抗体试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）、抗原 捕获酶联免疫吸附试验（ELISA)或反转录聚合酶链反应（RT-PCR)方法进行鉴定。 2 SN/T1129—2015 6竞争法荧光抗体试验 6.1 主要仪器设备 6.1.1倒置荧光显微镜。 6.1.2二氧化碳培养箱。 6.1.3单道可调移液器、多道可调移液器。 6.2试剂和材料 6.2.196孔平底细胞培养板，带盖湿盒。 6.2.2病毒：BVDV标准毒株（OregonC24V)。 6.2.3标准BVDV阳性血清：置一20℃保存，工作浓度按说明书稀释。 6.2.4BVDV荧光抗体：置4℃保存，工作浓度按说明书稀释。 6.2.5无水乙醇，20℃预冷。 6.2.6其他试剂和材料见5.2.3~5.2.7。 6.3操作程序 6.3.1将生长良好的牛肾原代细胞，用细胞分散液处理后，以生长液配制成1.5×105个/mL的细胞悬 液，加入96孔细胞培养板内，每孔100μL，置37℃培养。 6.3.2待细胞生长成80%的单层，吸出孔内生长液，用100μLMEM营养液洗涤1次，接种样品病毒分 离培养物，每孔50L，每个样品接种4个孔。同时设阳性（标准毒株）、阴性（空白细胞）对照各2孔，置 37℃二氧化碳培养箱吸附1h。 6.3.3吸出各板孔内所加的样品病毒培养物以及阳性、阴性对照液体，加入维持液，每孔100L，置 37℃二氧化碳培养箱培养3d。 6.3.4吸出各板孔内的维持液，用PBS洗1次，加一20℃预冷无水乙醇100L，固定20min以上，弃 去无水乙醇，自然干燥备用。 6.3.5取固定、自然干燥的96孔培养板，每个待检样品选择2个孔（样品组半数）分别加入BVDV阳性 血清各50μL，剩余2个待检样品孔以及阳性、阴性对照孔内加人PBS50μL，放人带盖湿盒，置37℃作 用1 h。 6.3.6弃去板孔内液体，用PBS洗涤3次，每次1min～3min，倾去液体，在所有板孔内加人工作浓度 的BVDV荧光抗体50μL，放人带盖湿盒，37℃作用1h。 6.3.7用PBS洗涤3次，每次1min~3min，倾去液体，荧光显微镜检查。 6.4结果判定 6.4.1在荧光显微镜下阳性对照孔的细胞呈黄绿色荧光，见黄绿色荧光的细小颗粒散布于细胞浆内， 阴性对照孔细胞无荧光。如果阳性对照、阴性对照不成立，则试验无效，重新检测。 6.4.2未经阳性血清抑制的样品孔细胞呈较亮荧光，形态清晰，而经过阳性血清抑制的同一样品无荧 光，则判为阳性。 6.4.3未经阳性血清抑制的样品孔细胞呈微弱荧光，而经过阳性血清抑制的同一样品孔细胞无荧光， 则为可疑，应重新检测，仍然呈微弱荧光，则判为阳性，重检后无荧光则判为阴性。 3 SN/T 1129—2015 7免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA) 7.1 主要