SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4140—2015 出口鱼肉香肠和香精中多种 杂环胺的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of heterocyclic amines in fish sausage and essence for export- LC-MS/MS method 行业标准信息服务平台 2015-02-09发布 2015-09-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4140—2015 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国新疆出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：赵善贞、周瑶、伊雄海、曹晨、曲栗、郭德华、邓晓军、李锋格、苏敏 行业标准信息服务平台 1 SN/T4140—2015 出口鱼肉香肠和香精中多种 杂环胺的测定液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本标准规定了出口食品和食品添加剂中1-甲基-9H-吡啶4，3-b吲哚（Harman）、9H-吡啶4，3-b 吲哚（Norharman）、2-氨基-9H-吡啶［2，3-b］吲哚（AaC）、2-氨基-3-甲基-9H-吡啶［2，3-b］吲哚 （MeAaC）、2-氨基-16-二甲基咪唑-［4,5-b]吡啶（DMIP）、3-氨基-1，4-二甲基-5H-吡啶并［4,3-b］吲哚 基-3，4-二甲基咪唑-［4,5-门喹啉（MeIQ）、2-氨基-3-甲基咪唑-[4，5-门喹喔啉（IQx）、2-氨基-3，8-二甲 基咪唑-[4,5-f喹喔啉（8-MeIQx）、2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑-［4，5-f门喔啉（7，8-DiMeIQx）、2-氨基 14种杂环胺的制样和液相色谱-质谱/质谱测定方法。 本标准适用于鱼肉香肠、肉脯以及柠檬香精、咸味香精中14种杂环胺的测定。 2方法提要 试样中的杂环胺类物质用乙睛提取，正已烷除去部分脂质杂质；香精中的杂环胺类物质用甲醇提 取，调节至PH5.5～6.5。提取液以固相萃取小柱净化，液相色谱-质谱/质谱检测和确证，内标法定量。 3试剂材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为去离子水。 3.1乙睛：高效液相色谱级。 3.2甲醇：高效液相色谱级。 标准信息服 3.3 正已烷：高效液相色谱级。 3.4 甲酸：高效液相色谱级。 3.5 浓盐酸：浓度36%~38%。 3.6 氨水：浓度25%~28%。 3.7 氢氧化钠。 3.8 甲酸铵：高效液相色谱级， 3.9 0.1mol/L盐酸溶液：准确量取9mL浓盐酸（3.5），水稀释定容至1L 3.10 0.1mol/L氢氧化钠溶液：精确称取4.0g氢氧化钠（3.7），水稀释定容至11 3.11 10mmol/L甲酸铵溶液：精确称取0.63g甲酸铵（3.8），水稀释定容至1L。 3.12 3.13 甲醇-氨水（90+10，体积比）：量取90mL甲醇（3.2），加人10mL氨水（3.6），混勾。现用现配。 3.14标准品：见附录A。 3.15标准储备溶液：取适量标准品（3.14），分别用甲醇溶解定容至终浓度为500μg/mL，一18℃避光 冷冻保存。 3.16标准中间溶液：用甲醇分别稀释标准储备溶液（3.15）至终浓度为10μg/mL，于4℃避光冷藏 1 SN/T4140—2015 保存。 3.17内标储备溶液：取适量Norharman-d7（3.14），用甲醇溶解定容至终浓度为500μg/mL，一18℃避 光冷冻保存。 3.18内标中间溶液：用甲醇稀释内标储备溶液（3.17)至终浓度为10μg/mL，于4℃避光冷藏保存。 3.19强阳离子固相萃取柱1或相当者：60mg3mL。 4仪器和设备 4.1 液相色谱-质谱/质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 4.2分析天平：感量0.0001g和0.01g。 4.3均质器。 4.4 涡旋混匀器。 4.5 5冷冻离心机：4000r/min和15000r/min。 4.6 固相萃取装置。 4.7 氮吹浓缩仪。 4.8 3pH计。 5试样制备与保存 5.1鱼肉香肠、肉脯 取样品中有代表性的可食部分约500g，用组织捣碎机充分捣碎混匀，装人洁净容器作为试样，密 封，并标明标记。将试样置于一18℃避光保存。 5.2香精 取有代表性的样品约500g，充分混匀，装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样置于常 温处避光保存。 5.3在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化 行业标准信 6 测定步骤 6.1提取 6.1.1香肠、肉脯 准确称取2g（精确至0.01g）样品置于50mL具盖离心管中，加人适量内标中间溶液（3.18），3mL 水均质混匀，加人5mL乙睛和5mL正已烷提取。涡旋混合5min.4℃、4000r/min离心5min。取 出乙层于另一玻璃试管中，在试样中再加入5mL乙腈，均质混句重复提取一次。涡旋混合5min， 4℃、4000r/min离心5min。合并乙睛层，待净化 1）非商业性声明：3.19所列固相萃取小柱是菲罗门Strata-X-C强阳离子交换小柱。此处列出固相萃取小柱仅为 提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家不同类型的固相萃取小柱。 2 SN/T4140—2015 6.1.2香精 准确称取2g（精确至0.01g）样品置于50mL具盖离心管中，加人适量内标中间溶液（3.18），3mL 水均质混匀，加入3mL甲醇提取。涡旋混合5min，4℃、4000r/min离心5min。取出甲醇-水溶液层 于另一玻璃试管中，用0.1mol/L盐酸（3.9）或者0.1mol/L氢氧化钠（3.10）调节至pH5.5~6.5，待 净化。 6.2净化 强阳离子固相萃取柱（3.19）依次用3mL甲醇、3mL水活化，转移香肠、肉脯（6.1.1）或者香精 （6.1.2）中提取液至固相萃取柱的顶部，以0.5mL/min流速过柱。用3mL0.1mol/L盐酸（3.9）、3mL 甲醇淋洗小柱，抽干5min，弃淋洗液。用6mL甲醇-氨水（3.13）溶液洗脱，收集的洗脱液于40℃水浴 中氮吹至干，用1mL10mmol/L甲酸铵溶液（3.11）振荡溶解残渣后，15000r/min离心10min，取上 清液，供液相色谱-质谱/质谱测定 7测定 7.1 高效液相色谱条件 7.1.1 色谱柱：C18柱，100mmX3.0mm（内径），粒度1.8μm，或相当者 7.1.2 流动相：A：10mmol/L甲酸铵溶液（3.11），B：含0.1%甲酸的乙睛（3.12）。 7.1.3 ：流速：0.25mL/min，梯度洗脱程序见表1。 7.1.4 柱温：常温。 7.1.5 进样量：10μL。 表1# 梯度洗脱程序表 梯度时间/min 流动相A/% 流动相B/% 0 95 5 5.0 95 5 10.0 06 10 15.0 70 30 22.0 66 24.5 01 66 25.0 95 5 30.0 95 5 7.2 质谱条件 7.2.1 离子源：电喷雾ESI，正离子。 7.2.2 扫描方式：多反应监测MRM。 7.2.3其他参考质谱条件：参见附录B。 3 SN/T 4140—2015 7.3液相色谱-串联质谱测定 7.3.1定性测定 按照液相色谱-质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，如果检测的色谱峰保留时间与标准品- 致，定性离子对的相对丰度是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示，应当与浓度相当标准工作溶液 的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >50% >20%~50% >10%~20% ≤10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 7.3.2定量测定 根据试样中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析，标准曲线工作液应有 5个浓度水平。标准工作液和待测液中14种物质的响应值均应在仪器线性响应范围内。如果含量超 过线性范围，应用基质空白溶液稀释到合适浓度后分析。在上述色谱条件下的参考保留时间参见附录 B中表B.1,标准溶液中待测物的多反应监测色谱图参见附录C中图C.1。 7.4空白试验 除不加试样外，均按上述操作步骤进行。 7.5结果计算和表述 用色谱数据处理机或按式（1)计算试样中杂环胺的残留含量，计算结果需扣除空白值： CXciXAXAsiXV 1000 .(1) 1000 csiXAiXA.Xm 式中： 试样中杂环胺残留量，单位为微克每千克（μg/kg）； ri 标准工作液中杂环胺的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； 从标准曲线上得到的杂环胺残留量的溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； ci A 样品中待分析物的面积； Asi 标准工作液中内标物的峰面积； 服 V 样液最终定容体积，单位为毫升（mL）； Csi Ai- -样品中内标分析物的面积； A 标准工作液中待分析物的峰面积； m 最终样液代表的试样质量，单位为克（g）。 8测定低限、回收率 8.1测定低限(LOQ) 本方法的测定低限为10μg/kg。 4 SN/T 4140—2015 8.2回收率 肉脯、香肠、咸味香精、柠檬香精中14种杂环胺的回收率试验数据参见附录D中表D.1和表D.2 行业标准信息服务平台 5