ICS 65.050 SN C 53 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2574—2019 代替SN/T2574—2010 出口蜂王浆中双甲胖及其代谢产物残留 量的测定 液相色谱质谱／质谱法 Determination of amitraz and metabolites residues in royal-jelly for import and 业标准信息服务平台 2019-12-27发布 2020-07-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 业标准信息服务平台 以正式出版文本为准 SN/T2574—2019 前言 本标准依据按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 质谱法》。 本标准与SN/T2574一2010相比，主要技术变化如下： 一将标准名称改为《出口蜂王浆中双甲及其代谢产物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱 法》，相应英文名称改为《Determinationof amitrazand metabolites residuesin royal-jellyfor export一LC- MS/MS method》。 将第一法气相色谱－质谱法删除。 增加液相色谱－质谱/质谱法 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：浙江省检验检疫科学技术研究院。 本标准主要起草人：侯建波、谢文、洪灯、张文华、 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T2574—2010。 业标准信息服务平台 以正式出版文本 业标准信息服务平台 以正式出版文本为准 SN/T2574—2019 出口蜂主浆中双甲胖及其代谢产物残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本标准规定了蜂王浆中双甲及其代谢产物单甲胖，2.4-二甲基苯基甲酰胺和2.4-二甲基苯胺 残留量的液相色谱－质谱/质谱法测定方法。 残留量的测定和确证。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法。 3方法提要 试样加氨水溶液稀释后用氨水乙睛溶液沉淀蛋白并提取，通过中性氧化铝固相萃取柱对提取液 进行净化，采用液相色谱-质谱/质谱仪检测，双甲、单甲和2，4-二甲基苯胺采用内标法定量， 2,4-二甲基苯基甲酰胺采用外标法定量。 4试剂和材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1 乙腈：色谱纯。 4.2 甲酸：色谱纯。 4.3 氨水：含量25%~28%，分析纯。 4.4 5%氨水溶液：量取95mL水和5mL氨水（4.3），混勺。 4.5 5%氨水乙腈溶液：量取95mL乙（4.1）和5mL氨水（4.3），混匀。 4.6（ 0.15%甲酸溶液：量取900mL水和1.5mL的甲酸（4.2），混匀，定容至1000mL。 4.7 双甲胖标准品（CH2N3，CAS号：33089-61-1）：纯度大于99.0% 4.9 单甲胖标准品（CH,4N2，CAS号：33089-74-6）：纯度大于99.0%。 4.102,4-二甲基苯基甲酰胺标准品（C,HmNO，CAS号：60397-77-5：纯度大于99.0% 4.11双甲胖-D.同位素内标标准品（CigHi,D.N）：纯度大于99.0%。 4.122,4-二甲基苯胺-D同位素内标标准品（C.H,DN）：纯度大于99.0%。 4.13双甲胖标准储备液：准确称取10mg（精确到0.1mg）双甲标准品（4.7）于100mL容量瓶中， 用乙睛（4.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为100μg/mL的标准储备液，于0℃～4℃冰箱内储存， 有效期4周。 1 SN/T2574—2019 4.142,4-二甲基苯胺标准储备液：准确称取10mg（精确到0.1mg）2,4-二甲基苯胺标准品（4.8）于 100mL容量瓶中，用乙（4.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为100μg/mL的标准储备液，于0℃~ 4℃冰箱内储存，有效期4周。 4.15单甲胖标准储备液：准确称取10mg（精确到0.1mg）单甲胖标准品（4.9）于100mL容量瓶中， 用乙睛（4.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为100μg/mL的标准储备液，于0℃~4℃冰箱内储存， 有效期4周。 准品（4.10）于100mL容量瓶中，用乙睛（4.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为100μg/mL的标准 储备液，于0℃~4℃冰箱内储存，有效期1周。 4.17双甲-D。同位素内标标准储备液：准确称取10mg（精确到0.1mg）双甲-D。同位素内标标 准品（4.11）于100mL容量瓶中，用乙睛（4.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为100g/mL的标准 储备液，于0℃~4℃冰箱内储存。 4.182,4-二甲基苯胺-D.同位素内标标准储备液：准确称取10mg（精确到0.1mg)2,4-二甲基苯胺-D 同位素内标标准品（4.12）于100mL容量瓶中，用乙晴（4.1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为100 Hg/mL的标准储备液，于0℃~4℃冰箱内储存。 4.19标准工作溶液：根据需要用乙睛（4.1）将标准储备液稀释至合适浓度的标准工作溶液，现用 现配。 4.20中性氧化铝固相萃取柱：1g，3mL（3mL乙和3mL5%氨水乙睛溶液依次活化），或相当者。 4.21( 0.22μm微孔滤膜，有机相。 5仪器和设备 5.2旋涡混合器。 5.3离心机：转速大于10000r/min。 5.4电子天平：感量为0.01g和0.1mg。 5.5氮吹仪 5.6具塞离心管：15mL和50mL 6试样制备与保存 取代表性样品约500g，将其用力搅拌均匀，将试样均分成两份装人洁净容器内，密封，并标明 信息服务平 标记。一份作为试验样，另一份在-18℃以下保存。在制样过程中，应防止样品受到污染或发生所测 物残留量的变化。 7测定步骤 7.1提取 称取约2g试样（精确至0.01g）于50mL聚塞离心管中，加入同位素内标（200μL，100ng/mL）， 加8mL5%氨水溶液（4.4），2000r/min，涡旋混合1min，静置5min，加10mL5%氨水乙溶液 （4.5），2000r/min，涡旋混匀1min，静置5min，加5%氨水乙腈溶液（4.5定容至20mL，涡旋混匀， 8500r/min离心5min，移取上清液2.0mL，加2mL5%氨水乙腈溶液（4.5），涡旋混匀，8500r/min 离心5min，取上清液待净化 2 SN/T2574—2019 7.2净化 将提取溶液转移至中性氧化铝固相萃取柱（4.20），接收流出液，加2mL5%氨水乙睛溶液（4.5） 洗涤中性氧化铝固相萃取柱，接收全部流出液，40℃下氮气吹至0.5mL以下，加乙腈（4.1）至2 mL，再加2mL水，涡旋混匀，过0.22μm微孔滤膜（4.21），待LC-MS/MS测定。 7.3测定 7.3.1液相色谱参考条件 7.3.1.1液相色谱柱：Cl8色谱柱，150mm×4.6mm（内径），5μum，或相当者。 7.3.1.2 进样量：10μL。 7.3.1.3 柱温：25℃。 7.3.1.4 流动相：0.15%甲酸溶液（4.6）和乙腈（4.1）梯度洗脱，见表1。 表1液相色谱梯度洗脱程序 时间 /min 流速/mL/min 0.15%甲酸溶液/% 乙腈1% 0.00 0.4 40.0 8.00 0.4 65.0 9.00 0.7 95.0 14.00 0.7 5.0 95.0 15.00 60.0 40.0 0.7 16.00 60.0 40.0 19.00 60.0 40.0 7.3.2 质谱/质谱参考条件 7.3.2.1 电离方式：电喷雾电离，正离子。 扫描模式：多反应监测（MRM）。 7.3.2.2 7.3.2.3 鞘气、碰撞气等均为高纯氮气；使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求，参考条件 及监测离子对（m/z）见附录A。 7.4标准曲线的绘制 取空白样品按照7.1和7.2处理。用所得的样品溶液将标准工作溶液稀释得到浓度为0.00ng/mL、 0.25ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL的标准工作曲线溶液，按浓度由低到高的顺序 进样检测，外标法以定量离子峰面积一浓度作图，内标法以定量离子峰面积与内标物峰面积比值一浓 度作图，得到标准曲线。 7.5定性 按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一 致（变化范围在±2.5%之内）；样品中目标化合物的定性离子的相对丰度与浓度相当的标准溶液一 致，相对丰度偏差不超过表2的规定，则可判断样品中存在待测化合物。 3