SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4504—2016 出口化妆品中氯倍他索、倍氯米松、氯倍 他索丙酸酯的测定 液相色谱-质谱/ 质谱法 Determination of clobetasol,beclomethasone and clobetasol propionate in cosmeticsHPLC-MS/MS method 行业标准信息服务平台 2016-06-28发布 2017-02-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4504—2016 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：白桦、李海玉、张庆、马强、孟宪双、王婉、郭项雨、王志娟。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4504—2016 出口化妆品中氯倍他索、倍氯米松、氯倍 他索丙酸酯的测定液相色谱-质谱/ 质谱法 1范围 本标准规定了水剂、膏霜类出口化妆品中氯倍他索、倍氯米松、氯倍他索丙酸酯的液相色谱-质谱/ 质谱检验方法 本标准适用于水剂、膏霜类出口化妆品中氯倍他索、倍氯米松、氯倍他索丙酸酯的检验。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 直接称取水剂膏霜类化妆品，用甲醇溶解，涡旋混勾，然后超声提取激素类药物，离心取上清液，经 固相萃取柱净化，用反相高效液相色谱串联质谱测定，外标法定量。 4试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水， 4.1乙腈：色谱纯。 甲醇：色谱纯。 甲酸：分析纯。 4.4 氯倍他索标准物质：C2H28CIFO4CAS号25122-41-2，纯度≥98%。 4.51 倍氯米松标准物质：C22H2gCIO5，CAS号4419-39-0，纯度98%。 4.6 氯倍他索丙酸酯标准物质：C25H32CIFO5，CAS号25122-46-7.纯度99% 4.7标准储备液：分别准确称标准物质氯倍他索（4.4）、倍氯米松（4.5）氯倍他索丙酸酯（4.6）各50mg 标准单标储备溶液，于4℃保存。 4.8标准混合工作溶液：分别取标准储备液（4.7）1mL混合，用甲醇定容于100mL容量瓶，制成浓度 10mg/L的标准混合储备液，于4℃C保存，临用时用初始流动相溶液稀释成100ng/mL、50ng/mL、 20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、lng/mL等系列浓度的标准混合工作溶液，用于制作标准 曲线。 4.9OasisHLB固相萃取柱或相当者：60mg，3mL。 4.10微孔滤膜：有机膜，孔径0.2μm。 1 SN/T 4504—2016 5仪器和设备 5.1 高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI源）。 5.2 分析天平，感量为0.001g和0.1mg。 5.3 超声波清洗器。 5.4 离心机，10000r/min。 5.5 涡旋混合器。 5.6 固相萃取装置。 5.7 氮吹仪。 6 测定步骤 6.1 样品处理 6.1.1提取 称取化妆品试样0.5g（精确到0.001g），置于10mL具塞离心管中，准确加人5mL甲醇，涡旋分散 溶解，充分混匀，超声提取20min，低温10000r/min离心10min，转出上清液于50mL锥形瓶中，加人 20mL超纯水，混匀，直接上固相萃取小柱净化。 6.1.2净化 将HLB固相萃取柱置于固相萃取装置上，小柱预先依次用5mL甲醇，10mL水活化，将待净化的 样品清液（6.1.1)全部流经柱子（有的样品过滤的特别慢，需要加压或抽滤），待样品溶液完全流尽后，用 5mL30%的甲醇水清洗锥形瓶，并淋洗固相萃取柱，淋洗完后，用5mL甲醇缓慢洗脱HLB柱，收集洗 脱液于10mL比色管中，最后真空抽滤，吸出小柱中的残留液，然后加入5mL高纯水，混合，经0.2μm 微孔滤膜过滤后待上机。 厂业标 6.2测定 6.2.1 液相色谱条件 色谱柱：XBridgeCis柱：150mm×2.1mm，粒径3.5μm，或相当者； a) 信息服 b) 柱温：30℃： c) 进样体积：5μL； d) 液相色谱流动相及参考分离条件见表1。 表1 液相色谱流动相及参考分离条件文 时间/min 流速/(mL/min) 乙睛/% 含0.1%甲酸的水溶液/% 607 0.0 0.3 40 1.5 0.3 50 50 5.0 0.3 70 30 5.1 0.3 90 10 7.0 0.3 90 10 2 SN/T4504—2016 表1 (续) 时间/min 流速/(mL/min) 乙腈/% 含0.1%甲酸的水溶液/% 7.1 0.3 40 60 9.0 80 40 60 6.2.2 质谱参考条件 以下为质谱参考条件： a) 电离方式：电喷雾电离，ESI（+）； b) 干燥气：氮气； c) 碰撞气：氩气； (P 干燥气温度：500℃； e) 干燥气流量：800L/Hr； f) 检测方式：多反应监测（MRM)： g) 毛细管电压：3.0kV； h) 3种糖皮质激素的质谱测定参数见表2。 表23种糖皮质激素药物的质谱测定参数 化合物 保留时间/min 母离子（锥孔电压)/V 子离子（碰撞能量） 倍氯米松 2.43 409.2(22) 373.2(9) 391.2"(12) 氯倍他索 3.81 411.2(19) 373.2"(14) 391.2(9) 氯倍他索丙酸酯 5.33 467.2(21) 355.2(13) 373.2(10) 定量离子。 6.2.3 标准工作曲线绘制 分别移取5μL浓度为1ng/ml,2ng/mL,5ng/mL,10ng/mL,20ng/mL,50ng/mL,100ng/mL,的 标准工作溶液（4.8），按色谱条件（6.2.1）进行测定，以色谱峰的峰面积为纵坐标，对应的溶液浓度为横坐 标作图，绘制标准工作曲线。标准物质色谱图参见附录A。 6.2.4定性测定 在上述液相色谱-质谱/质谱条件下测定试样和标准工作溶液，外标标准曲线法测定样液中的待测 物含量。试样中待测物含量应在标准曲线范围之内，如果含量超出标准曲线范围，应进行适当稀释。在 背景后的样品质量色谱图中，所选择的离子对均出现，同时与标准品的相对丰度允许偏差不超过表3规 定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。 表3定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度/% >50 >20~50 >10~20 ≤10 允许的相对偏差/% ±20 ±25 ±30 ±50 3 SN/T 4504—2016 6.3 平行试验 按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。 6.4 空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤进行。 结果计算 相同实验条件下测定标准溶液和样品溶液，制作标准曲线，样品中糖皮质激素的含量用外标法定 量，按式（1）计算含量，计算结果保留三位小数。 cXV X = ..(1) 1000Xm 式中： X 样品中某种被测组分含量，单位为微克每克（μg/g）； 由标准曲线得出的样液中某种组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V——样液定容体积，单位为毫升（mL）； 样品质量，单位为克（g）。 m 8测定低限 本方法对3种糖皮质激素的测定低限均为0.1ug/g。 9 回收率 在低、中高（0.1μg/g、1μg/g、2μg/g）三个添加浓度，水剂样品的回收率范围为83.8%~109.9%； 膏霜样品的回收率范围为80.3%～109.8%。 业标准信息服务平台 SN/T4504—2016 附录A (资料性附录） 色谱图 三种糖皮质激素标准溶液液相色谱质谱/质谱总离子流图见图A.1。 氯倍他索丙酸酯，CAS号25122-46-7 5. 37 LO01 TTT 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 时间/min 氯倍他索，CAS号25122-41-2 3.85 100- % 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 行业标准信息服 时间/min 倍氯米松，CAS号4419-39-0 2.45 100- 时间/min 图 A.1 三种糖皮质激素标准溶液液相色谱质谱/质谱总离子流图（50ng/mL） 5