SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4274—2015 国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌 O157:H7的三重荧光PCR检测方法 Detection of Salmonella ,Shigella and Escherichia coli O157:H7 by triplex real-time PCR at frontier ports 行业标准信息服务平台 2015-05-26发布 2016-01-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4274—2015 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国四川出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫 局、上海之江生物科技股份有限公司。 本标准主要起草人：樊学军、田绿波、王莹、陈肖潇、石莹、杨雨、倪卫琴、朱旭平、王宁。 行业标准信息服务平台 一 SN/T4274—2015 国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌 O157：H7的三重荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157：H7三重荧光PCR检测的对象，标本 的采集、运输和保存，检测程序及结果报告 本标准适用于国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157：H7的筛选检测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T4789.17食品卫生微生物学检验肉与肉制品检验 GB4789.18食品安全国家标准食品微生物学检验乳与乳制品检验 GB/T4789.19食品卫生微生物学检验蛋与蛋制品检验 GB/T 4789.20 食品卫生微生物学检验 水产食品检验 GB/T 4789.21 食品卫生微生物学检验 冷冻饮品、饮料检验 GB/T 4789.22 食品卫生微生物学检验 调味品检验 GB/T 4789.23 食品卫生微生物学检验 冷食菜、豆制品检验 GB/T4789.24食品卫生微生物学检验 糖果、糕点、蜜钱检验 GB19489 实验室生物安全通用要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 沙门氏菌Salmonella 属肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌。菌体大小(0.7μm~1.5μm)×（2.0μm～5.0μm），无芽胞，一般无 荚膜，除鸡白痫沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外，大多有周身鞭毛。包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、 伤寒和副伤寒的细菌。甚至可导致严重脱水以及急性肾功能衰竭而亡。 3.2 志贺氏菌Shigella 属肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌。大小为（0.5μm～0.7μm）×（2um~3μm），无芽胞，无荚膜，无鞭 毛。多数有菌毛。是人类细菌性痫疾最为常见的病原菌。志贺氏菌所致菌痢的病情较重，以全身中毒 症状和下部大肠化性炎症为主要特征，严重者可发生感染性休克和（或）中毒性脑病。 3.3 大肠杆菌0157:H7Escherichiacoli0157:H7 属肠杆菌科埃希氏菌属属肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌。大小（0.4μm～0.7μm）×（1μm~3μm）， 无芽胞，有普通菌毛与性菌毛。可致人腹泻、出血性结肠炎，5%~10%的病例并发溶血性尿毒综合征 1 SN/T4274—2015 (HUS)及血栓性血小板减少紫癜(TTP)等。 3.4 荧光PCRfluorescencepolymerasechain reaction 又称为实时荧光PCR（real-timePCR），实时荧光PCR方法有多种，本标准采用的是TaqMan水解 探针法，其原理是在常规PCR的基础上，加入一条特异性的荧光探针，该探针为一条寡核苷酸，两边分 别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸 收，PCR扩增时，利用Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光灭基团分 离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一 个同步指数增长的过程，信号的强度与检测对象的核酸含量成正比，可根据数学模型计算出检测对象的 含量。 3.5 Ct 值cycle threshold 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：聚合酶链反应（polymerasechainreaction） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) Taq酶：Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase) MGB：小沟结合物，一种荧光淬灭基团（minorgroovebinder） 5检测对象 5.1疑似沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7感染者的临床标本如粪便。 5.2疑似沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157：H7污染环境标本如水样，以及食品。 6生物安全和PCR防污染要求 6.1检测工作中的个人防护参照GB19489。 6.2实验室应遵循GB19489对生物安全2级（BSL-2)实验室的生物安全要求。 息服务平台 6.3使用过的实验用品应遵循GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。 7仪器和试剂 7.1仪器和器材 本方法使用主要仪器和器材： 实时荧光定量PCR仪及配套PCR反应管： 生物安全柜； 高速台式离心机（离心速度13800g以上）； 台式离心机（离心速度900g）； 漩涡振荡器； 恒温水浴锅； 2 SN/T4274—2015 一高压灭菌锅； 低温冰箱、冷藏、冷冻冰箱； 微量可调移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL）及配套带滤芯吸头； 离心管(1.5mL)。 7.2试剂 7.2.1生理盐水 蒸馏水和NaCI浓度配制为0.9%的生理盐水。 7.2.2 检测试剂盒 试剂盒包括以下组分： a) DNA提取液（含0.9%NaCI和0.1%EDTA-Na²的混合液）； b) 10XPCR缓冲液(500mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2,100 mmol/LTris·HCl,pH8.3); c) dNTP(10o mmol/L); d) Taq 酶(5 U/μL); e) 阴性对照品（灭菌双蒸水ddH,O)； f) 阳性对照品（人工制备含沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157：H7检测序列的质粒）； g) 引物和探针（详见7.2.3）。 7.2.3引物和探针 引物和探针序列如下： a）沙门氏菌： 上游引物:5'-TTTCCTGCGGTACTGTTAATTAC-3 下游引物：5'-GGCTTCAATCAAGATAAGACG-3 探针:5-FAM-TTCGTCTGGCATTATC(MGB)-3 b）志贺氏菌： 上游引物:5'-ATGTTAAGGTTGCAGCTCTCTTTG-3 下游引物：5'-ACAATACTCCTTGAGCACCATACG-3 探针:5'-HEX-TTCTTGACATCCTCCACG(MGB)-3" c）大肠杆菌O157:H7： 息服务平台 上游引物:5'-ACGGTTCAGGCCACTACAGG-3" 下游引物：5'-TCTTTCGCCAGCACGTTCAC-3'° 探针:5'-Red 610-ACTAACTCCGATTCTGA(MGB)-3 8 检测程序 8.1林 样本的采集 8.1.1 粪便标本 采集病人发病早期新鲜粪便于一次性无菌采便管内，成形便采集5g～8g，水样便采集1mL~ 3mL。亦可用以湿润的直肠棉插人直肠内3cm～5cm处并轻轻旋转，有可见粪便的棉拭放人采便 管内。采便管外表贴上带有唯一识别号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检 3 SN/T4274—2015 8.1.2水样标本 水样用无菌容器采集3mL～5mL，密闭后外表贴上带有唯一识别号码的标签，直接用于检测，或 保存，或送检。 8.1.3食品标本 8.1.3.1 肉与肉制品的取样方法按GB/T4789.17的规定。 8.1.3.2 乳与乳制品的取样方法按GB4789.18的规定。 8.1.3.3 蛋与蛋制品的取样方法按GB/T4789.19的规定。 8.1.3.4 各种水产食品及其制品的取样方法按GB/T4789.20的规定。 8.1.3.5 清凉饮料的取样方法按GB/T4789.21的规定 8.1.3.6 调味品的取样方法按GB/T4789.22的规定。 8.1.3.7 冷食菜、豆制品的取样方法按GB/T4789.23的规定。 8.1.3.8 糖果、糕点、蜜钱的取样方法按GB/T4789.24的规定。 8.2 2样本的运送与保存 样本运输采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封运输。对于不立即检测的样本，应保存于一20℃待检。 8.3 3样本的前处理 8.3.1粪便标本 采集成形便5g～8g（尽可能取黏液脓血部分），放置于有0.5mL生理盐水的离心管中，振荡混勾， 16200g离心2min。去尽上清液，沉淀用于核酸提取 8.3.2水样标本 取标本3mL，16200g离心2min。去尽上清液，沉淀用于核酸提取。 8.3.3食品标本 取处理后的标本1mL～3mL,16200g离心2min。去尽上清液，沉淀用于核酸提取。 8.4样本的DNA提取 在标本的前处理沉淀中，加人100μLDNA提取液充分混匀，沸水浴10min（误差不超过1min）。 服务平台 16200g离心5min，上清可直接用于荧光PCR反应。也可以使用商品化的DNA提取试剂盒并按其 说明书操作。 8.5 荧光PCR检测 8.5.1试剂配制 反应体系设置为40μL