ICS11.020 SN CCS C 62 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4624.182021 入境环保用微生物菌剂检测方法 第18部分：短短芽孢杆菌 Test method of import microbe agentia in the environment protection - Part 18:Brevibacillus brevisr 2021-06-18发布 2022-01-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T4624.18—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件为SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》的第18部分。SN/T4624已经发布了以 下部分： 第1部分：地衣芽孢杆菌 第2部分：短小芽孢杆菌 第3部分：巨大芽孢杆菌 第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌 -第5部分：β型溶血性链球菌 第6部分：金黄色葡萄球菌 第7部分：沙门氏菌 第8部分：志贺氏菌 第9部分：致泻大肠埃希氏菌 第10部分：淡紫拟青霉 第11部分：雅致小克银汉霉 第12部分：哈茨木霉 第13部分：黄孢原毛平革菌 第14部分：焦曲霉 出版文本为准 第15部分：解淀粉芽孢杆菌 第16部分：类产碱假单胞菌 第17部分：恶臭假单胞菌 第18部分：短短芽孢杆菌 第19部分：红串红球菌 第20部分：泛养副球菌 本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国沈阳海关、二连浩特国际旅行卫生保健中心。 信息服务平台 本部分主要起草人：王金玲、张莹、杨喜凤、罗力涵、李大力。 SN/T4624.182021 入境环保用微生物菌剂检测方法 第18部分短短芽孢杆菌 1范围 本文件规定了人境环保用微生物菌剂短短芽孢杆菌（Brevibacillusbrevis）的形态学鉴定、生化鉴 定、实时荧光PCR检测方法。 本文件适用于人境环保用微生物菌剂短短芽孢杆菌检测和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文件的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 4短短芽孢杆菌分类地位 学名：Brevibacillus brevis 分类地位：芽孢杆菌科（Bacillaceae），短芽孢杆菌属（Brevibacillus）。 你 5方法原理 分离纯化菌株后，进行形态学鉴定、生化鉴定、实时荧光PCR检测，根据菌的形态特征结果 生化鉴定结果、实时荧光PCR特异性片段扩增结果，3项结果都符合时判断该菌是否为目标菌株 服务平台 6仪器设备 6.1 电子天平（感量0.01g） 6.2恒温培养箱：30℃±1℃、50℃±1℃。 6.3恒温振荡培养箱：30℃±1℃。 6.4恒温水浴锅。 6.5台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。 6.6PCR扩增仪 6.7 生物显微镜：10×~100×。 SN/T 4624.18-2021 6.8厌氧培养装置：30℃±1℃。 6.9微量移液器和灭菌吸头：10μL、20μL、200μL、1000μL。 6.10高压灭菌锅。 6.11PCR超净工作台。 6.12电泳仪。 6.13核酸/蛋白分析仪。 6.14凝胶成像系统。 6.15无菌培养皿：直径90mm。 7主要试剂和培养基 7.1实验用水（应符合CB/T6682中一级水的规格）。 7.2营养琼脂：按附录A中A.1配制。 7.3营养肉汤：按附录A中A.2配制。 7.4革兰氏染色法相关试剂：按附录A中A.3配制。 7.5芽孢染色法相关试剂：按附录A中A.4配制。 7.6接触酶：按附录A中A.5配制。 7.7 氧化酶：按附录A中A.6配制。 本为准 糖发酵管（葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇）：按附录A中A.7配制。 7.8 7.9 硝酸盐还原：按附录A中A.8配制 7.10 7%NaCI生长：按附录A中A.9配制。 7.11 淀粉水解：按附录A中A.10配制。 7.12 明胶：按附录A中A.11配制。 7.13TE缓冲液（pH值8.0）：按附录A中A.12配制 7.141%~3%琼脂糖凝胶：按附录A中A.13配制。 7.1525mMEDTA：按附录A中A.14配制。 7.16 S3M醋酸钠：按附录A中A.15配制。 7.17 dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP配制。 7.18TBE：按附录A中A.16配制。 7.19 TaqDNA聚合酶。 7.20 细菌基因组DNA提取试剂盒。 7.21琼脂糖。 7.22 溴化乙锭。 7.23DNA分子量标记：100bpDNAladder。 8样品制备、培养 8.1以无菌操作取1g（mL）样品加人到100mL生理盐水中混匀，移取1环菌连续划线接种5个营 养琼脂平板，30℃±1℃培养18h~24h。取样过程中，在样品旁边放置1个营养琼脂平板作为空白 对照。 8.2挑取平板上3~5个菌落平坦、光滑，色泽白色，生长后期一般黄灰色的菌落进行形态学鉴定。 8.3挑取符合形态学特征单菌落转营养琼脂平板纯培养，30℃±1℃条件下培养18h~24h；再从 纯培养平板上挑取菌落接种营养肉汤，30℃±1℃条件下180r/min振荡培养18h~24h。 2 SN/T4624.182021 9形态学鉴定 9.1培养性状 短短芽抱杆菌在营养琼脂上的菌落平坦、光滑，色泽白色，生长后期一般黄灰色 9.2形态特征 革兰氏染色及芽孢染色：将8.2中平板上的菌落做涂片进行革兰氏染色，将该平板在冰箱中放置 48h待形成芽孢后，进行芽孢染色，镜检。 短短芽孢杆菌为革兰氏阳性杆菌，菌体宽度1.2μm~1.5μm，长度2.0μm~5.0μm，内生孢子，芽 孢不膨大，不形成伴胞晶体。 10 生化鉴定 也可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等。 取8.3中菌液利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定，每个生化管加入100μL增菌肉汤。 短短芽孢杆菌生化特征见表1。 表1短短芽孢杆菌生化特征 鉴定项目 X 短短芽孢杆菌 接触酶 + 氧化酶 +/- 厌氧生长 + 葡萄糖 + 式出版文 木糖 L-阿拉伯糖 - 甘露醇 硝酸盐还原 + 50℃生长 pH值5.7生长 7%NaCI生长 淀粉水解 明胶液化 11分子生物学检测 11.1 细菌模板DNA的提取 11.1.1直接提取法 取8.3中菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，10000r/min离心2min，尽量弃净上清液（如果 3