ICS11.020 SN CCS C 62 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4624.202021 入境环保用微生物菌剂检测方法 第20部分：泛养副球菌 Test method of import microbe agentia in the environment protection - Part 2O:Paracoccus pantotrophus 2021-06-18发布 2022-01-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 行业标准 入境环保用微生物菌剂检测方法 第20部分：泛养副球菌 SN/T 4624.202021 * 务平台 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号（100023） 编辑部：（010）65194242-7531 网址www.customskh.com/book 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张1字数31千字 2021年7月第一版2021年7月第一次印刷 印数1—500 * 书号：155175327 定价18.00元 SN/T4624.20—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件为SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》的第20部分。SN/T4624已经发布了以 下部分： 第1部分：地衣芽孢杆菌 第2部分：短小芽孢杆菌 第3部分：巨大芽孢杆菌 第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌 第5部分：β型溶血性链球菌 第6部分：金黄色葡萄球菌 第7部分：沙门氏菌 第8部分：志贺氏菌 第9部分：致泻大肠埃希氏菌 第10部分：淡紫拟青霉 第11部分：雅致小克银汉霉 第12部分：哈茨木霉 第13部分：黄孢原毛平革菌 第14部分：焦曲霉 出版文本为准 第15部分：解淀粉芽孢杆菌 第16部分：类产碱假单胞菌 第17部分：恶臭假单胞菌 第18部分：短短芽孢杆菌 第19部分：红串红球菌 第20部分：泛养副球菌 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国沈阳海关、诺微信（沈阳）生物技术有限公司。 信息服务平台 本文件主要起草人：王金玲、张莹、李秀峰、王旭、于丽、张淼 SN/T4624.202021 入境环保用微生物菌剂检测方法 第20部分泛养副球菌 1范围 本文件规定了人境环保用微生物菌剂泛养副球菌（Paracoccuspantotrophus）的检测方法。 本文件第一法适用于人境环保用微生物菌剂泛养副球菌的定性检测；第二法适用于入境环保用 微生物菌剂中泛养副球菌的定量检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 4泛养副球菌分类地位 正式 学名：Paracoccus pantotrophus。 曾用名：Thiosphaera pantotropha。 分类地位：科（aerobicchemolithotrophicbacteriaandassociatedorganism），球硫细菌属（Thiosphaera）。 5方法原理 分离纯化菌株后，进行形态学鉴定、生化鉴定实时荧光PCR检测，根据菌的形态特征结果、 生化鉴定结果、实时荧光PCR特异性片段扩增结果，3项结果都符合时判断该菌为目标菌株。 6主要仪器和设备 6.1电子天平（感量0.01g）。 6.2恒温培养箱：35℃±1℃。 6.3恒温振荡培养箱：35℃±1℃。 6.4腕式振荡器。 6.5恒温水浴锅。 6.6 台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。 SN/T4624.202021 6.7实时荧光PCR扩增仪。 6.8生物显微镜：10×~100×。 6.9微量移液器和灭菌吸头：10μL、20μL、200μL、1000μL。 6.10高压灭菌锅。 6.11PCR超净工作台。 6.12电泳仪。 6.13核酸/蛋白分析仪。 6.14 凝胶成像系统。 6.15无菌培养皿：直径90mm。 7 主要试剂和培养基 7.1实验用水（应符合GB/T6682中一级水的规格）。 7.2 磷酸盐缓冲液：按附录A中A.1配制。 7.3硫酸链霉素胰蛋白陈大豆琼脂：按附录A中A.2配制。 7.4 接触酶：按附录A中A.3配制。 7.5氧化酶：按附录A中A.4配制。 7.6 甲基红试验：按附录A中A.5配制。 7.7 糖发酵管：按附录A中A.6配制。 7.8 硝酸盐还原试验培养基：按附录A中A.7配制。 文本为准 7.9 淀粉水解试验培养基：按附录A中A.8配制。 7.10 TE缓冲液（pH值8.0）：按附录A中A.9配制。 7.11 1%~3%琼脂糖凝胶：按附录A中A.10配制。 7.1225mMEDTA：按附录A中A.11配制。 7.133M醋酸钠：按附录A中A.12配制。 7.14、dNTP :dATP、dTTP、dGTP、dCTP。 7.15TBE：按附录A中A.13配制。 7.16TagDNA聚合酶。 7.17细菌基因组 DNA提取试剂盒。 7.18琼脂糖。 7.19 溴化乙锭。 第一法泛养副球菌定性检测 8样品制备、培养 8.1以无菌操作称取1g（mL）样品加人到99mL无菌磷酸盐缓冲液中，在室温下用腕式振荡器震 荡10min，振荡器震荡速率300次/min~400次/min，制成1：100的样品匀液。取样过程中，在样品 旁边放置1个营养琼脂平板作为空白对照。 8.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：100样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL无菌磷酸 盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），并在振荡器上进行振摇，至少振 摇15s，制成1：1000的样品匀液， 2 SN/T4624.20—2021 8.3按8.2操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。 8.4根据对样品菌量的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释的同时， 每个稀释度分别移取1环菌连续划线接种5个硫酸链霉素胰蛋白陈大豆琼脂平板，35℃±1℃培养 48h。取样过程中，在样品旁边放置1个营养琼脂平板作为空白对照。 9形态学鉴定 9.1培养性状 泛养副球菌在硫酸链霉素胰蛋白陈大豆琼脂上的菌落圆形、颜色大多数为白色、淡黄色，表面 光滑，边缘整齐。 9.2形态特征 革兰氏染色：将8.4中平板上的菌落做涂片进行革兰氏染色，镜检。泛养副球菌为革兰氏阴性短 杆状或球形、近球形的菌，不运动，不形成芽孢。 10生化鉴定 为准 也可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等。 取8.4中菌液利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定，每个生化管加入100μL增菌肉汤。 泛养副球菌生化特征见表1。 表1泛养副球菌生化特征 鉴定项目 泛养副球菌 接触酶 + 氧化酶 + 甲基红试验 一 甘露糖 葡萄糖 硝酸盐还原 +/ 淀粉水解 唯信息服务 11分子生物学检测 11.1细菌模板DNA的提取 11.1.1直接提取法 取8.4中菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，10000r/min离心2min，尽量弃净上清液（如果肉 眼观察沉淀量不可见或较少时，可重复此步操作。沉淀加人TE100μL、10mg/mL溶菌酶100μL，37 ℃温育30min，12000r/min离心2min，沉淀加TE缓冲液600μL重悬，再加人15mg/mL蛋白酶 K25μL，55℃温育1h后沸水浴10min，12000r/min离心5min，取上清液保存于-20℃保存以待检测。 11.1.2有机溶剂提取法 取8.4中菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，10000r/min离心2min，尽量弃净上清液（如 果肉眼观察沉淀量不可见或较少时，可重复此步操作）。沉淀加人TE缓冲液570μL重悬，然后 3