ICS67.050 SN C 53 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5216—2020 商品化试剂盒检测方法 乳酸链球菌素方法一 -NisinTestMethodI 业标准信息服务平台 以正式 2020-08-27发布 2021-03-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 业标准信息服务平台 以正式出版文本为准 SN/T5216—2020 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国乌鲁木齐海关、北京勤邦生物技术有限公司。 本标准主要起草人：孟茹、周均、尚爽、罗琼、齐鑫、万宇平、梁振纲、高艳菲、牛娜。 业标准信息服务平台 以正式出版文本为准 业标准信息服务平台 以正式出版文本为准 SN/T5216—2020 商品化试剂盒检测方法 乳酸链球菌素方法一 1范围 本标准规定了食品中乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法 本标准适用于检测含乳饮品及肉制品等食品中乳酸链球菌素A及乳酸链球菌素Z的含量。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T2775商品化食品检测试剂盒评价方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 乳酸链球菌素 nisin 正式出版文本关 乳酸乳球菌发酵后提取而制得的食品添加剂乳酸链球菌素，是一种多肽物质，由34个氨基酸残 基组成。用于食品添加剂的有NisinA和NisinZ两种类型：NisinA的分子式为Ci40H230O3,N42S7，相 对分子量为3354.35Da；NisinZ的分子式为C14oH23oO37N42S7，相对分子量为3330.31Da。两种类型 的乳酸链球菌素分子结构在第27位的氨基酸不同，NisinA第27位氨基酸为组氨酸，NisinZ第27 位氨基酸为天冬酰胺。 4方法提要 样品中的乳酸链球菌素和试剂盒中微孔条上预包被的抗原竞争乳酸链球菌素抗体，加人酶标二 抗后，用底物显色液显色，样本吸光值与所含乳酸链球菌素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以 其对应的稀释倍数，即可得出样品中乳酸链球菌素的含量。 5材料和试剂 除另外说明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水 5.1乳酸链球菌素检测试剂盒。试剂盒评价参见SN/T2775，具体评价结果参见附录A。试剂盒组成 如下： a）96孔酶标板：12条×8孔（包被偶联抗原）； 1 SN/T5216—2020 b） 乳酸链球菌素标准品：0mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、2.5mg/L、12.5mg/L、62.5mg/L； 高浓度标准品：100mg/L； c） 酶标记物浓缩液； e） 抗体工作液； f) 浓缩清洗液； 样品提取液； g） h）显色液：底物A、底物B； i）终止液。 试剂盒应在4℃~8℃避光条件下保存，溶解后的酶标记物应在-15℃条件下冻存。 盐酸。 5.3 氢氧化钠。 5.4 正已烷。 6仪器 6.1 天平：量程100g，感量0.01g。 6.2 酶标仪：波长450nm。 涡旋仪。 6.3 6.4 离心机。 6.5 混合振荡器。 文本为准 6.6 6.7 多道移液器：30μL~300μL。 6.8 聚苯乙烯离心管：2mL、10mL、 6.9 研钵或粉碎装置。 7 试样的制备和提取 正式出版 7.1牛奶、饮料类液体样品：用样品提取液将样本稀释10倍，取50μL用于分析。样品稀释倍数为10。 7.2乳制品、肉制品类固体样品：称取25g（精确到0.01g）样品，用研钵或粉碎装置将样品制成 粉末状或直径小于0.3mm的颗粒状，称取1g（精确到0.01g）粉末状制备好的样品至50mL离心管 里，加入5mL样品提取液，旋涡振荡混匀5min，3000r/min离心5min后静置10min，提取上清 1mL至离心管里（注意不要吸到表层的油脂和底层的沉淀），取50uL用于分析。样品稀释倍数为5 8分析步骤 8.1操作条件 所有操作应在室温下（20℃~25℃）进行，乳酸链球菌素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至 室温后方可使用。 8.2洗板条件 8.2.1人工洗涤次数4次，每次注人洗涤工作液250μL/孔。 8.2.2自动洗板预定4次。 8.3酶标仪测定条件 2 SN/T5216—2020 酶标仪测定波长为450nm。 8.4测定步骤 8.4.1将测定需用的微孔板条插入微孔架上，标记标准液和样品等在微孔架上的位置。 8.4.2吸取50μL乳酸链球菌素标准工作溶液（浓度分别为：0mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、2.5mg/L、 12.5mg/L、62.5mg/L）和样品溶液于对应的微孔中。 8.4.3每孔加人50μL抗体工作液，振荡混匀，用封孔膜封孔条，置37℃避光环境中反应30min。 8.4.4揭开封孔膜，倒掉孔中的溶液，加洗涤工作液，按8.2条件进行洗板。将微孔架反扣在吸水纸 上反复拍打，除去孔内残留的洗涤工作液。 8.4.5吸取100μL酶标记结合物溶液到每个微孔中，振荡混匀，用封孔膜封孔后置37℃避光环境 中反应30min，重复8.4.4洗涤微孔。 8.4.6吸取100μL显色液到每个微孔中，振荡混匀，用封孔膜封孔后置37℃避光环境中反应 15 min。 8.4.7吸取100μL终止液到每个微孔中，振荡混匀，将微孔架置于酶标仪中，在450nm处测量吸 光度OD值。 8.5平行试验 按以上步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定。 8.6空白试验 9结果计算 9.1 百分吸光度值B=B/B。×100% (1) 式中： 标准品或样品溶液的平均吸光度值； -0mg/L标准溶液的平均吸光度值。 9.2以标准品百分比吸光度值为纵坐标（%），乳酸链球菌素标准溶液浓度（mg/L）为横坐标，绘制 标准工作曲线，将样品的百分吸光度代人标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的乳酸链球菌素 的浓度后，结果按式（2）计算： X=c × V (2) 式中： X一一样品中乳酸链球菌素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）， 从标准工作曲线上得到的样品中乳酸链球菌素浓度，单位为毫克每毫升（mg/L）； -样品的稀释倍数。 也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算，所得结果表示至一位小数 9.3若样品B值高于标准工作溶液的B值范围，应对样品进行稀释后重新测试 3