SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4259—2015 出口水果蔬菜中链格孢菌毒素的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of alternaria toxins residues in fruit and vegetables for export-LC-MS/MS method 行业标准信息服务平台 2015-05-26发布 2016-01-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4259—2015 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国陕西出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：李建华、何强、孔祥虹、邹阳、张璐、李莹、付骋宇。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4259—2015 出口水果蔬菜中链格孢菌毒素的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本标准规定了水果和蔬菜中链格孢霉素、链格孢酚、腾毒素、链格孢酚甲醚四种链格孢菌毒素含量 的液相色谱-串联质谱检测方法。 本标准适用于苹果、梨、葡萄、猕猴桃、柑桔、西红柿、黄瓜、白菜、辣椒等样品中链格孢霉素、链格孢 酚、腾毒素、链格孢酚甲醚含量的测定和确证。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3方法提要 试样中的链格孢菌毒素用乙腈提取后，经聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物固相萃取柱串联氨基固相萃 证，外标法定量。 4 试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。 标准信息服务平 4.1 乙腈：HPLC级。 4.2 甲醇：HPLC级。 4.3 二氯甲烷。 4.4 乙酸乙酯。 4.5 环已烷。 4.6 甲酸。 4.7 氯化钠。 4.8 无水硫酸钠：650℃灼烧4h，贮于密封容器中备用。 4.9 乙酸乙酯-环已烷（1+1，体积比）：量取1000mL乙酸乙酯与1000mL环已烷混合均匀。 4.10 甲醇-水溶液（1十4，体积比）：量取100mL甲醇与400mL水混合均匀。 4.11甲酸-甲醇-乙酸乙酯溶液（0.5+50+50.体积比）：量取100mL甲醇、100mL乙酸乙酯、1mL甲 酸混合均匀。 4.12乙-水溶液（1十1，体积比）：量取100mL乙睛与100mL水混合均匀。 4.13链格孢霉素标准物质（Altenuene，CisHi.O，CAS：29752-43-0）：纯度大于等于99.0%。 4.14链格孢酚标准物质（Alternariol,C4H1。Os，CAS：641-38-3）：纯度大于等于98.5%。 1 SN/T4259—2015 4.15腾毒素标准物质（Tentoxin，C22HsoN,O4，CAS：28540-82-1）：纯度大于等于99.5%。 4.16链格孢酚甲醚标准物质（Alternariolmonomethyl-ether，CisHizO，，CAS26894-49-5）：纯度大于 等于99.0%。 4.17标准储备溶液：准确称取适量的链格孢霉素、链格孢酚、腾毒素、链格孢酚甲醚，分别用乙睛制成 100μg/mL的标准储备溶液，0℃~4℃保存。 4.18混合标准工作溶液：分别取适量的链格孢霉素、链格孢酚、腾毒素、链格孢酚甲醚标准储备液，根 据需要用乙睛-水溶液（4.12）逐级稀释，配制成适当浓度的标准工作溶液。0℃～4℃保存。 4.19聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物固相萃取柱：HLB柱，60mg，3mL或相当者。使用前依次用3mL 甲醇、5mL水活化，保持柱体湿润。 4.20氨基固相萃取柱：500mg，3mL。使用前在柱上端装填约2cm高的无水硫酸钠（4.8），然后用 5mL二氯甲烷活化，保持柱体湿润。 4.21 微孔滤膜：0.2um，有机系。 5仪器和设备 5.1液相色谱-串联质谱仪：配有ESI电离源、串联四级杆质量分析器。 5.2凝胶渗透净化系统。 5.3分析天平：感量0.01mg、0.01g。 5.4组织捣碎机。 5.5振荡器。 5.6 离心机：转速不低于3000r/min。 固相萃取装置，带真空泵。 减压旋转蒸发器。 5.9氮吹仪。 5.10具塞离心管：50mL。 5.11 浓缩瓶：50mL、100mL。 6试样制备与保存 取代表性样品约500g，将其可食用部分切碎后，用组织捣碎机将样品加工成浆状，混勺，装人洁净 的容器内，密闭并标明标记，于－18℃冷冻保存。不 息服务平台 注：在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化 7测定步骤 7.1提取 7.1.1苹果、梨、葡萄、猕猴桃、柑桔、西红柿、黄瓜、白菜 称取5g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加入4g氯化钠，10mL水，15mL乙腈，振荡提 取10min，3000r/min离心5min，将上层乙提取液转移到浓缩瓶中。再分别用15mL乙睛重复提 取两次，合并乙睛提取液，于40℃水浴中减压浓缩至近干，氮气吹干，用1.0mL甲醇溶解残渣，再用 9.0mL水稀释，过滤，待净化。 2 SN/T4259—2015 7.1.2辣椒 称取5g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加人4g氯化钠，10mL水，15mL乙睛，10mL 正已烷，振荡提取10min，3000r/min离心5min，用玻璃吸管移取中间的乙睛层于浓缩瓶中。再分别 用15mL乙睛重复提取两次，合并乙睛提取液，于40℃水浴中减压浓缩至近干，氮气吹干，用10.0mL 乙酸乙酯-环已烷（4.9）溶解残渣，过滤，待净化。 7.2净化 7.2.1苹果、梨、葡萄、猕猴桃、柑桔、西红柿、黄瓜、白菜 取提取液（7.1.1)5.0mL加人HLB固相萃取柱（4.19），待样品溶液流完后，保持柱体湿润，用5mL 甲醇-水（4.10）淋洗，减压抽干2min，将氨基柱（4.20）串接在HLB固相萃取柱下方，用5mL二氯甲烷 淋洗，弃去淋洗液，再用7mL甲酸-甲醇-乙酸乙酯溶液（4.11）洗脱，整个净化过程保持2mL/min~ 3mL/min的流速，收集洗脱液，40℃减压蒸至近干，氮气吹干，用2.00mL乙睛-水（4.12）溶解定容，过 0.2μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定和确证。 7.2.2辣椒 取提取液（7.1.2)5.0mL用凝胶渗透色谱净化，收集洗脱液，于40℃减压蒸至近干，加入2mL二 氯甲烷，过氨基柱（4.20)净化，用2mL二氯甲烷洗涤浓缩瓶，洗涤液一并过氨基柱，再用5mL二氯甲 烷淋洗，弃去淋洗液，用7mL甲酸-甲醇-乙酸乙酯溶液（4.11)洗脱，整个净化过程保持2mL/min～ 3mL/min的流速，收集洗脱液，40℃减压蒸至近干，氮气吹干，用2.00mL乙睛-水（4.12）溶解定容，过 0.2um滤膜，供液相色谱-串联质谱测定和确证。 凝胶渗透色谱净化参考条件： 凝胶柱：内径25mm，柱长400mm，填料为Bio-Beads-S-X3Beads（200mesh~400mesh），或 相当者； b) 流动相：乙酸乙酯-环已烷（4.9）； c) 流速：5.0ml/min； 进样量：5.0mL； e) 收集方式：时间模式，收集19.0min~30.0min洗脱流出液。 标准信息 7.3测定 7.3.1 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下： 色谱柱：Cls柱，长50mm，内径2.1mm，粒径1.7μm，或相当者； a)1 b) 流动相：乙睛-水梯度洗脱，参见表1，梯度变化模式为线性递增或递减； 表1流动相条件 时间 流速 乙腈 水 min mL/min % % 0.00 0.30 15 85 3.00 0.30 70 30 3 SN/T 4259—2015 表1 (续) 时间 流速 乙 水 min mL/min % % 3,50 0.30 70 30 3.60 0.30 15 85 5.00 0.30 15 85 柱温：35℃； d) 进样量：2.0μL。 7.3.2 质谱参考条件 质谱检测参考条件参见附录A。 7.3.3液相色谱-串联质谱检测及确证 7.3.3.1定量测定 根据样液中链格孢霉毒素含量情况，选定与样液浓度相近的标准工作溶液，标准工作溶液和样液中 链格孢霉毒素的响应值均应在仪器检测线性范围内，如果样液中链格孢霉毒素含量超出检测的线性范 围，则稀释后再进样。对标准工作溶液和样液等体积分时段参插进样测定，外标法定量，在7.3规定的 色谱及质谱条件下，4种链格孢霉毒素标准品的液相色谱-串联质谱选择性离子流图参见附录B中图 B.1。 7.3.3.2定性测定 对标准工作液及样液按7.3规定的条件进行测定时，如果样液与标准工作液的选择离子图中，样液 中目标物质的保留时间与相近浓度标准溶液的保留时间偏差在土2.5%以内；且定性离子对的相对丰度 与相近浓度标准溶液对应定性离子对的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为 样品中存在对应的待测物。 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度/% >50 >20~50 >10~20 ≤10 允许的相对偏差/% 服务平台 ±20 ±25 ±30 ±50 7.4空白试验 除不加试样外，均按上述检测步骤进行。 7.5结果计算和表述 用色谱数据处理机或按式（1)）计算试样中链格孢霉毒素含量。 AXc.XV X = ...(1) A.Xm 式中： 试样中链格孢霉毒素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； 4 SN/