ICS 67.050 SN CCS C 53 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5360—2021 出口动物源食品中万古霉素和去甲万古霉 素残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of vancomycin and norvancomycin residue in foodstuffs of animal origin for export -LC-MS/MS method 2021-11-22发布 2022-06-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T5360—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国长春海关、中华人民共和国厦门海关、中华人民共和国西宁海关、 中华人民共和国深圳海关、中华人民共和国南京海关、中华人民共和国天津海关。 本文件主要起草人：康明芹、徐敦明、苏姗姗、赵风娟、陈明岩、张代辉、胡婷婷、张勋 SN/T5360—2021 出口动物源食品中万古霉素和去甲万古霉 素残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本文件规定了出口动物源性食品中万古霉素和去甲万古霉素的液相色谱-质谱/质谱测定方法。 本文件适用于动物肌肉、肝脏、肾脏、水产品、蜂蜜、鸡蛋、乳及乳制品中万古霉素和去甲万古霉素的 测定和确证。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 4方法提要 样品中残留的万古霉素和去甲万古霉素以0.1%甲酸水-乙睛提取，经混合型强阳离子交换柱净化 后，用液相色谱-质谱/质谱仪测定，外标法定量。 5试剂和材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 信息服务平 5.1甲醇。 5.2乙：色谱纯。 5.3甲酸。 5.4二氯甲烷。 5.5氮水。 5.60.1%甲酸溶液：准确移取1mL甲酸，用水定容至1000mL。 5.70.1%甲酸-乙腈溶液（1+1，体积比）：量取500mL乙睛与500mL的0.1%甲酸溶液（5.6）， 混匀。 5.92%甲酸溶液：准确移取20mL甲酸，用水定容至1000mL。 5.1010%氨水-甲醇溶液：量取100mL氨水，用甲醇定容至1000mL。 5.110.1%甲酸-乙腈溶液饱和的二氯甲烷：量取100mL二氯甲烷和50mL0.1%甲酸-乙腈溶液 1 SN/T5360—2021 （5.7）于分液漏斗中，充分混合后静置，取下层。 5.12定容液：量取950mL0.1%甲酸溶液（5.6）和50mL乙睛，混匀。 5.13标准物质：万古霉素标准物质（vancomycin，C66H75ClNO24，CASNo.1404-93-9）；去甲万古霉 素标准物质（norvancomycin，C65H3Cl,NO24，CASNo.91700-98-0）。标准物质为可溯源至SI单位或 国家基准的有证标准物质或标准溶液。 5.14万古霉素标准储备液：准确称取盐酸万古霉素标准物质适量（精确至0.1mg）于小烧杯中，用 0.1%甲酸（5.6）溶解并全部转移至容量瓶中，定容至刻度，配成溶液浓度以万古霉素计为1000ug/mL 的标准储备液。0℃～4℃避光保存，有效期3个月。 5.15去甲万古霉素标准储备液：准确称取万古霉素标准物质适量（精确至0.1mg）于小烧杯中，用 0.1%甲酸溶液（5.6）溶解并全部转移至容量瓶中，定容至刻度，配成以去甲万古霉素计为1000ug/mL 的标准储备液。0℃～一4℃避光保存，有效期3个月。 5.16万古霉素和去甲万古霉素混合标准中间液：准确吸取万古霉素标准储备液（5.14）和去甲万古霉 混合标准中间液。0℃～4℃以下避光保存，有效期1个月。 5.17万古霉素和去甲万古霉素混合标准工作液：吸取一定量的标准中间溶液，用0.1%甲酸溶液 (5.6)稀释配制成不同浓度的系列标准工作溶液，浓度分别为5.0ug/L、10.0μg/L、20.0μg/L、 50.0μg/L、100.0μg/L现用现配。 5.18混合型强阳离子交换柱（SPE）：60mg，3mL，或相当者，使用前用3mL2%甲酸甲醇（5.8）和 6mL2%甲酸溶液（5.9）活化。 5.19微孔滤膜：0.22μm，聚四氟乙烯有机滤膜。 5.202 乙二胺-N-内基硅烷（PSA）。 5.21 1十八烷基硅烷键合硅胶（Cis）。 6仪器和设备 6.1液相色谱-质谱/质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI)。 6.2粉碎机。 6.3固相萃取装置。 6.4均质器。 小准信息服务平 6.6离心机：4000r/min。 6.7高速离心机：15000rmin。 6.8 涡旋混合器。 6.9氮吹仪。 7试样制备与保存 台 7.1猪肉、牛肉、鸡肉、猪肾、猪心、猪肝、鱼肉、鸡蛋 取样品中具有代表性的可食部分约500g，用粉碎机捣碎，装人洁净容器作为试样，密封并做好标 识，于一18℃以下保存。 7.2蜂蜜 取代表性样品约500g。对于无结晶的样品将其搅拌均匀；对于有结晶析出的样品，在密闭情况下， 2 SN/T5360—2021 将样品置于不超过60℃的水浴中温热，待样品全部融化后搅拌均匀，迅速冷却至室温。在融化时必须 注意防止水分挥发。装人洁净容器作为试样，密封并做好标识，于4℃以下保存。 7.3牛奶、奶粉 取代表性样品约500g，混合均匀后装入洁净容器作为试样，密封并做好标识，于4℃下保存。 8测定步骤 8.1提取 8.1.1猪肉、牛肉、鸡肉、猪肾、猪心、鱼肉 称取约5g试样（精确至0.01g）于均质管中，加人20mL0.1%甲酸-乙睛溶液（5.7），用均质器以 10000r/min均质2min，以4000r/min离心5min，取出上清液，残渣再用10mL0.1%甲酸-乙睛溶 液（5.7)重复提取一次，合并上清液并定容至30mL，混勾后取10mL于离心管中，加入0.5gPSA吸 附剂（5.20），涡旋混合2min后以15000r/min离心10min，取出6mL上清液待净化。 8.1.2蜂蜜、鸡蛋、牛奶 称取约5g试样（精确至0.01g）于均质管中，加人15mL0.1%甲酸-乙睛溶液（5.7），用均质器以 10000r/min均质2min，以4000r/min离心5min，取出上清液，残渣再用10mL0.1%甲酸-乙睛溶 液（5.7)重复提取一次，合并上清液并定容至30mL，混勾后取10mL于离心管中，加入0.5gPSA吸 附剂（5.20），涡旋混合2min后以15000r/min离心10min，取出6mL上清液待净化。 8. 1. 3猪肝 称取约5g试样（精确至0.01g）于均质管中，加入20mL0.1%甲酸-乙睛溶液（5.7)，用均质器以 10000r/min均质2min，以4000r/min离心5min，取出上清液，残渣再用10mL0.1%甲酸-乙睛溶 附剂（5.5）和0.5gC：吸附剂（5.21），涡旋混合2min后以15000r/min离心10min，取出6mL上清 液待净化。 8.1.4奶粉 称取约2g试样（精确至0.01g）于离心管中，加人20mL0.1%甲酸-乙睛溶液（5.7），涡旋混合 2min，以15000r/min离心10min，取出上清液，残渣再用10mL0.1%甲酸-乙溶液（5.7）重复提取 一次，合并上清液并定容至30mL后转移至分液漏斗中，加人20mL0.1%甲酸-乙睛溶液饱和的二氯 甲烷（5.11），混勾，静置分层后，取出15mL上清液待净化。 8.2净化 取7.1中待净化液全部转移至强阳离子交换柱（5.18），分别用3mL水和3mL甲醇以小于1mL/ min的速度淋洗，弃去，用3mL10%氨水-甲醇溶液（5.10）以小于1mL/min的流速洗脱于试管中，于 40℃下氮吹至近干，用1mL定容液（5.12）溶解，过0.22um滤膜（5.19），供液相色谱-质谱/质谱仪 测定。 3 SN/T 5360—2021 8.3测定 8.3.1 液相色谱条件 液相色谱条件如下： a) 色谱柱：C18柱，150mmX2.1mm（内径），粒度3.5μm，或相当者。 b) 柱温：35℃。 c) 流动相：A：0.1%甲酸水溶液；B：乙睛，梯度洗脱程序见表1； d) 流速：0.25mL/min。 进样量：20μL。 e) 表1 液相色谱梯度洗脱条件 时间/min 流动相A/% 流动相B/% 0.00 95 5.00 80 20 7.00 5 5 9.00 5 95 9.01 95 15.00 5 8. 3.2 质谱条件 质谱条件如下： 代出版 a) 离子源：电喷雾离子源（ESI） b) 扫描方式：多反应监测（MRM） c) 其他质谱条件参见附录A。 8.3.3液相色谱-质谱/质谱测定 8.3. 3. 1 定性测定 按照液相色谱-质谱/质谱条件测定样品和标准工作液，如果试样中待测物质的保留时间与标准工 作液一致，保留时间偏差在士2.5%以内，并且所监测的离子均出现（信噪比≥3），而且定性离子对的相 对丰度（是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示）与浓度相当的标准工作溶液的相对丰度允许偏差 不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的