ICS65.020 CCSB41 DB50 重庆市地方标准 DB50/T1407—2023 新城疫病毒免疫层析（胶体金） 检测技术规范 2023-05-25发布 2023-08-25实施 重庆市市场监督管理局 发布 DB50/T1407—2023 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的 规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由重庆市农业农村委员会提出、归口并组织实施。 本文件起草单位：重庆市动物疫病预防控制中心、重庆理工大学。 本文件主要起草人：曹芸、董春霞、吴胜昔、黄恒、陈忠琼、姚璐、蔺露、凌洪权、向梦玲、向梦 雪、孟丽娜。 DB50/T1407—2023 1新城疫病毒免疫层析（胶体金）检测技术规范 1范围 本文件规定了新城疫病毒免疫层析（胶体金）的检测原理、仪器与耗材、材料、样品前处理、样品 检测、结果判定、废弃物处理。 本文件适用于检测泄殖腔拭子、咽拭子、组织样品、鸡胚尿囊液及细胞培养液中的新城疫病毒。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T39707医疗废物处理处置污染控制标准 SN/T2984检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4检测原理 本文件采用双抗夹心法制备新城疫病毒胶体金试纸卡。在试纸卡的加样孔处加入待检样品，待检样 品中的抗原先与胶体金标记的新城疫病毒单克隆抗体反应，形成肉眼可见的红色金标结合物。结合物通 过毛细作用向前移动，抗原被包被于硝酸纤维膜（NC膜）上的羊抗新城疫病毒抗体（多克隆抗体）捕 获并截留，形成可见的紫红色检测线（简称T线）。如果样品中没有抗原，则不能形成红色的金标结 合物，流过T线时不发生捕获截留，T线保持白色。抗原抗体反应后未结合完的金标抗体继续层析与 羊抗Balb/C小鼠免疫球蛋白抗体结合，形成第二条结合线（质控线，简称C线），若C线不显示 红色，则检测结果无效。 胶体金试纸卡结构如图1所示： 图1胶体金试纸卡结构示意图 DB50/T1407—2023 25设备与耗材 Ⅱ级生物安全柜（洁净等级100级，对0.3μm颗粒过滤效率≥99.999%）、高速冷冻离心机（最 高转速22000r/min，温度范围：－20℃～＋40℃）、高压蒸汽灭菌器、电子天平（精确度0.001g）、 玻璃匀浆器（5mL）、移液器、棉拭子、塑料滴管、离心管。 6材料 胶体金试纸卡 6.1.1可制备或采用商品化产品。试纸卡制备方法见附录A。 6.1.2应室温或冷藏保存。 样品稀释液 6.2.1可配制或采用商品化的PBS试剂（pH7.2）。 6.2.2配制按如下配方：氯化钠（NaCl）8g、氯化钾（KCl）0.2g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.44g、 磷酸二氢钾（KH2PO4）0.24g，加蒸馏水至1000mL，将上述成分依次溶解，用盐酸（HCl）调pH至 7.2，分装，121℃、15min高压灭菌。 7样品前处理 一般要求 样品前处理应符合SN/T2984的规定。 泄殖腔和咽拭子 将收集的泄殖腔和咽拭子插入盛有0.8mL～1.0mL样品稀释液的离心管中，充分搅拌并反复挤压 试管壁，使附着的分泌物充分洗脱，置2℃～8℃，12,000r/min离心10min，取上清液待检。样品 须立即进行检测，若无法立即检测应冷藏保存，超过24小时的，应冷冻保存。 组织样品 称取组织块0.5g，置于匀浆器中，加pH7.2PBS试剂1mL，研磨完全后取出组织匀浆液，置 2℃～8℃，12,000r/min离心10min，取上清液待检。 鸡胚尿囊液 尿囊液样品置2℃～8℃，12,000r/min离心2min，取上清液待检。 细胞培养液 反复冻融3次，将细胞培养液置2℃～8℃，12,000r/min离心2min，取上清液待检。 8样品检测 取出胶体金试纸卡和样品恢复至室温，平放于桌面上，在试纸卡的加样孔中缓慢加入样品2～3滴 （100μL～150μL）。 DB50/T1407—2023 3 水平放置5min～10min，观察结果。 9结果判定 阳性 当试纸卡出现两条紫红色条带（T线和C线），结果判为阳性，记为“＋”。 阴性 当试纸卡仅出现一条紫红色条带（C线），结果判为阴性，记为“－”。 无效 如试纸卡未出现C线，不论是否出现T线，结果均判为无效。 10废弃物处理 应符合GB/T39707的规定。 DB50/T1407—2023 4AA 附录A （资料性） 新城疫病毒胶体金试纸卡的制备 A.1单克隆抗体制备 利用杂交瘤技术，通过细胞融合，筛选制成特异性新城疫病毒（NDV）单克隆抗体。该抗体针对 NDV血凝素，决定了试纸卡的特异性。 A.2多克隆抗体制备 A.2.1羊抗NDV抗体用纯化的NDV免疫山羊后，提取羊血清中的免疫球蛋白制成羊抗NDV 抗体。该抗体可与金标抗体——NDV抗原抗体复合物结合，形成夹心抗原抗体复合物，用于胶体金试 纸卡硝酸纤维膜（NC膜）的捕获线。 A.2.2羊抗Balb/C小鼠免疫球蛋白抗体用Balb/C小鼠的免疫球蛋白作为抗原，免疫山羊后，提 取羊血清中的免疫球蛋白制成羊抗Balb/C小鼠免疫球蛋白抗体。该抗体用于硝酸纤维膜（NC膜）的 质控线，可与金标抗体结合，以此检验试纸卡的有效性。 A.3金标抗体制备 用氯金酸制备30nm胶体金颗粒，将NDV单克隆抗体与胶体金颗粒按照18μg/mL进行标记， 标记完后用牛血清白蛋白（BSA）进行封闭。标记好的金标抗体用高速离心法进行纯化，去除游离抗体 和蛋白及其它小分子物质。采用1％BSA缓冲液将金标抗体悬浮保存。悬浮后的金标抗体在室温条件 下能保存一年以上。 A.4胶体金结合垫制备 将玻璃纤维膜浸泡于80mMNa2B4O7·10H2O，0.1％PVA，0.1％Tween‑20，0.3％BSA的处理 液中，于4℃条件下浸泡10～12h，37℃烘干4～5h。将制备的金标抗体喷涂于处理过的玻璃纤维 膜上，切成50mm宽度，即制成胶体金结合垫。 A.5胶体金样品垫制备 样品垫浸泡于80mMNa2B4O7·10H2O，0.1％PVA，0.1％Tween‑20，0.3％BSA的处理液中， 在37℃的温度下干燥2h后，切成40mm宽度，用于过滤样品中的有形成分，同时保证NDV抗 原不变性。样品垫置于试纸卡的最前端，样品孔的下端。 A.6试剂条板制备 将处理好的胶体金样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜（NC膜）、吸水垫纸按顺序依次粘贴在试剂条 板上。 A.7NC膜喷样 在制备好的试剂条板的NC膜上分别喷涂捕获抗体（羊抗NDV抗体）和质控抗体（羊抗Balb/C 球蛋白抗体），线宽1mm，喷完后于37℃下干燥。 A.8试剂条板切条和试纸卡组装