ICSICS 67.160.10 CCS X 62 团 体 标 准 T/ NAIA 0207-2023 酿酒葡萄及葡萄酒中有机酸的测定 液相色谱-质谱法 Determination of organic acids in wine grapes and wines Liquid chromatography-mass spectrometry (征求意见稿) 2023-04-28发布 2023-05-01实施 宁夏化学分析测试协会 发 布 发布TB 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。 本文件起草 单位：宁夏农产品质量标准与检测技术研究所、宁夏贺兰山东麓葡萄酒产业园区管 理委员会、宁夏农林科学院、宁夏食品检测研究院、西北农林科技大学、宁夏化学分析测试协会、 宁夏张裕龙谕酒庄有限公司 。 本文件主要起草人 ：陈翔、葛谦、吴燕、闫玥、张静、吕毅、马丹阳、赵丹青、张锋锋、杨斌 琨、陈望、张小飞、张伟、牛艳、孙翔宇、刘娜。 本文件为首次发布。 全国团体标准信息平台 酿酒葡萄及葡萄酒中有机酸的测定 液相色谱 -质谱法 1 范围 本文件规定了酿酒葡萄及葡萄酒中 有机酸含量的液相色谱 -质谱测定方法。 本文件适用于酿酒葡萄及葡萄酒中丙二酸 、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、L-酒石酸、奎宁酸、莽 草酸、柠檬酸、 DL-苹果酸、 L-乳酸含量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 术语和定义 本文件没有 需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中的有机酸经水提取，微孔滤膜过滤，液相色谱 -质谱法测定，外标法定量。 5 试剂与材料 除非另有规定，所有试剂均为分析纯，水 符合 GB/T 6682中规定的一级水。 5.1 乙腈（ CH3CN）：色谱纯。 5.2 甲酸（ HCOOH）：质谱纯。 5.3 乙酸乙酯（ C4H8O2）：色谱纯。 5.4 丙二酸（ Propanedioic Acid）：CAS号141-82-2，纯度 ≥99.7%；丙酮酸（ Pyruvic Acid）：CAS 号127-17-3，纯度 ≥97.0%；富马酸（ Fumaric Acid）：CAS号110-17-8，纯度 ≥99.5%；琥珀酸 （Amber Acid）： CAS号110-15-6，纯度 ≥99.1%；L-酒石酸（ L-Tartaric Acid）： CAS号 87-69-4，纯度 ≥99.8%；奎宁酸（Quinic Acid）CAS号77-95-2，纯度 ≥98.5%；莽草酸（Shikimic Acid）CAS号138-59-0，纯度 ≥98.7%；柠檬酸（Citric Acid）CAS号77-92-9，纯度 ≥99.8%；DL- 苹果酸（ DL-Malic Acid）CAS号6915-15-7 ，纯度 ≥99.8%；L-乳酸（ L-Lactic Acid）CAS号 79-33-4，纯度 ≥86.9%。 5.5 20 %甲醇溶液： 量取 20 mL甲醇，用水定容至 100 mL。 全国团体标准信息平台 5.6 标准溶液配制 5.6.1 有机酸单标储备溶液 ：分别准确称取（折算纯度）一定质量的有机酸标准品（ 精确至 0.01 mg）用20 %甲醇溶液溶解并分别定容至 10 mL，配制浓度为 10 mg/mL的单标储备液，于 -18 ℃保存。 5.6.2 有机酸混合标准溶 液：根据需要分别取适量有机酸单标储备液， 以20 %甲醇溶液（ 5.5）稀释 成1.0m g/L标准中间溶液， -18 ℃下保存。 6 仪器与设备 6.1 组织捣碎机。 6.2 超高效液相色谱 -三重四级杆串联质谱仪（ 配ESI离子源）。 6.3 分析天平：感量为 0.01mg。 6.4 电子天平： 感量 0.01g。 6.5 多管涡旋混合器。 6.6 台式离心机 6.7 超纯水仪。 6.8 离心管： 50mL，聚四氟乙烯。 6.9 滤膜： 0.45μm，水相（聚醚砜）。 7 分析步骤 7.1 试样的制备 酿酒葡萄样品 ：拣去霉烂变质的葡萄果实并去除果梗，使用组织捣碎机将酿酒葡萄匀浆， 分取 500g装入样品瓶中，贴好标签后于 -18℃冷冻保存待测。 葡萄酒样品： 于-18℃冷冻保存待测 。 7.2 样品提取 7.1 酿酒葡萄 称取 2.00 g（精确至 0.01 g）酿酒葡萄样品于 50 mL离心管（6.8）中，加入 20.0 mL水，1500 r/min 涡旋提取 1 min，4000 r/min离心 5 min，过 0.45 μm水相滤膜 (6.9)，上机待测。 7.2 葡萄酒 称取 1.00 g（精确至 0.01 g）葡萄酒样品于 50 mL离心管（ 6.8）中，加入 20.0 mL水， 1500 r/min 涡旋提取 1 min，4000 r/min离心 5 min，过 0.45 μm水相滤膜 (6.9)，上机待测。 7.3 测定 7.3.1 液相色谱参考条件 全国团体标准信息平台 a）色谱柱： C18色谱柱或性能相当者； b）柱温： 30 ℃； c）流速： 0.4 mL/min； d）流动相： A为0.1 %甲酸溶液； B为乙腈；梯度洗脱条件见表 1； e）进样体积： 1.0μL。 表1 流动相及梯度洗脱条件 （VA+VB） 时间 /min 流动相 VA/% 流动相 VB/% 0.00 95 5 14.0 70 30 15.0 70 30 16.0 90 10 18.0 90 10 19.0 95 5 20.0 95 5 7.3.2 质谱参考条件 a）离子源类型： ESI离子源； b）扫描模式：负离子模式，选择反应离子监测（ SRM），扫描参数见表 2； c）喷雾电压 2500 V； c）鞘气 35 Arb； d）辅气 10 Arb； e）离子传输管温度： 300 ℃； f）雾化温度： 350 ℃； 表2 有机酸多反应离子监测分析参数 序号 中文名 英文名 保留时间 离子对 Ⅰ 碰撞能量 V 离子对 Ⅱ 碰撞能量 V 1 丙二酸 Propanedioic Acid 1.03 103.0/41.1 26.9 103.0/59.1 8.5 2 丙酮酸 Pyruvic Acid 0.96 86.9/43.0 7.7 86.9/69.1 5.2 3 富马酸 Fumaric Acid 1.53 115.0/27.2 11.4 115.0/71.1 6.5 4 琥珀酸 Amber Acid 1.57 117.0/73.1 10.5 117.0/99.0 9.2 5 L-酒石酸 L-Tartaric Acid 0.86 149.0/73.1 16.0 149.0/87.0 12.4 6 奎宁酸 Quinic Acid 0.85 191.0/85.0 21.4 191.0/93.0 21.8 7 莽草酸 Shikimic Acid 0.97 173.0/93.1 13.5 173.0/111.1 9.7 8 柠檬酸 Citric Acid 1.23 190.9/87.0 16.8 190.9/111.1 11.2 全国团体标准信息平台 9 DL-苹果酸 DL-Malic Acid 1.00 133.0/71.0 14.2 133.0/114.9 9.9 10 L-乳酸 L-Lactic Acid 1.22 89.0/43.1 11.1 89.0/45.1 11.2 7.3.3 色谱测定与确证 根据试样中被测物的含量情况 ，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析 。标准工作液和试 样中被测物的响应值均应在仪器线性响应范围内。在上述仪器条件下，丙二酸、丙酮酸、富马酸、 琥珀酸、 L-酒石酸、奎宁酸、莽草酸、柠檬酸、 DL-苹果酸、 L-乳酸的保留时间分别约为 1.03、 0.96、1.53、1.57、0.86、0.85、0.97、1.23、1.00、1.22 min，选择离子监测色谱图参见附录 A。按 照上述条件进行样品测定 ，若检测样品的色谱峰保留时间与标准品一致 ，且与浓度相当标准工作溶 液的相对丰度一致 ，相对丰度允许偏差不超过表 3规定的范围 ，则可判断样品中存在对应的被测物 。 表3 定性确证相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >50% >20%~50% >10%~20% ≤1