ICS 13.060.01 CCS Z 17 团体标准 团体 标准 T/PSC 1.2—2022 船舶压载水检测方法 第2部分：大于等于 10 μm且小于50 μm 活体生物 Determination for ballast water of ships — Part 2: Viable organisms less than 50 micrometres in minimum diameter and greater than or equal to 10 micrometres in minimum diam eter 2022-01-01发布 2022-07-01实施 中国太平洋学会 发布 全国团体标准信息平台 T/PSC 1.2 —2022 I 目次 前言 ................................ ................................ ................. II 1 范围 ................................ ................................ ............... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ..... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ......... 1 4 方法原理 ................................ ................................ ........... 1 5 试剂 ................................ ................................ ............... 1 6 仪器及设备 ................................ ................................ ......... 2 7 样品检测 ................................ ................................ ........... 2 8 数据记录与计算 ................................ ................................ ..... 2 9 质量保证和控制 ................................ ................................ ..... 3 附录A（资料性） 压载水中大于等于 10 μm且小于50 μm活体生物检测结果记录 ............... 4 参考文献 ................................ ................................ .............. 5 全国团体标准信息平台 T/PSC 1.2 —2022 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件是 T/PSC 1—2021《船舶压载水检测方法 》的第2部分。T/PSC 1—2021已经发布了以下部分 ： ——船舶压载水检测方法 第1部分：大于等于 50 μm活体生物。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由 中国太平洋学会东海环境分会 提出。 本文件由 中国太平洋学会 归口。 本文件起草单位： 上海海洋大学、国家海洋局东海环境监测中心、国家海洋局东海标准计量中心。 本文件主要起草人：吴惠仙、王琼、龚婉卿、何彦龙、薛俊增、林玲、袁林。 全国团体标准信息平台 T/PSC 1.2 —2022 1 船舶压载水检测方法 第2部分：大于等于 10 μm且小于50 μm活体生物 1 范围 本文件规定了用双荧光染色法检测船舶压载水样品中大于等于 10 μm且小于50 μm的活体生物的仪 器设备和试剂 、样品检测、数据记录与计算、质量保证和控制。 本文件适用于船舶压载水大于等于 10 μm且小于50 μm活体生物的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 IMO MEPC.300(72) ：2018 压载水管理系统认可规则（ Code for approval of ballast water management systems (BWMS CODE) ） IMO BWM.2/Circ.42 ：2020 压载水取样和分析试用指南（ G2导则）（ Guidance on ballast water sampling and analysis for trial use in accordance with the BWM Convention and Guidelines(G2) ） 3 术语和定义 下列术语和定义适 用于本文件。 大于等于 10 μm且小于50 μm活体生物 viable organisms less than 50 micrometres in minimum 3.1 dimension and greater than or equal to 10 micrometres in minimum dimension 生物体最小尺寸小于 50 μm但大于或等于 10 μm的具有繁殖能力的生物，包括该粒径范围内部分异 养生物和浮游植物。 异养生物 heterotrophic organism 3.2 经荧光素二乙酸酯（ FDA）与5-氯甲酸荧光素酯（ CMFDA）双荧光染色后，在蓝色光激发条件下不发 绿色荧光的活体生物。 4 方法原理 染色剂FDA是一种非荧光化合物，能穿越完整细胞质膜，进入细胞原生质体后受酯类酶作用，分解 形成荧光素 。荧光素不能自由地穿越细胞质膜，积累在有活力的细胞中，在蓝光激光照射下，产生绿色 荧光。无活力细胞不能分解 FDA，无荧光产生。染色剂 CMFDA本身不具有发荧光特性，能穿过细胞膜进入 活体细胞内，其中的亲脂性基团被胞浆内非特异性酯酶水解，生成 5－氯甲基荧光素，发出绿色荧光。 目前利用 FDA和CMFDA对压载水中浮游生物进 行共同染色，在荧光显微镜下观察生物死活，计算样品中存 活的大于等于 10 μm且小于50 μm生物的数量。 5 试剂 除非另有说明，本方法仅使用去离子水和分析纯试剂。 全国团体标准信息平台 T/PSC 1.2 —2022 2 5 μM/mL荧光素二乙酸酯（ FDA）：将1.25 mg FDA 溶解到3 mL的二甲基亚砜中，并混合均匀 , 5.1 常温避光保存。 2.5 μM/mL 5-氯甲酸荧光素酯（ CMFDA）：将1 mg CMFDA 溶解到3 mL的二甲基亚砜中，并混合 5.2 均匀，常温避光保存。 二甲基亚砜： 99.7%。 5.3 6 仪器及设备 本方法所用仪器设备均应经过计量检定校准，且在有效期内。 6.1 正置荧光显微镜（型号： OLYMPUS BX53 ），蓝色激发光，波长范围 450 nm～435 nm，放大倍数 100 6.2 ×。 涡旋混合器。 6.3 浮游生物计数框， 1 mL。 6.4 移液枪，量程 1 mL，10 μL。 6.5 离心管， 1 mL。 6.6 7 样品检测 样品采集 7.1 7.1.1 据IMO MEPC.300(72) ：2018的2.8.6.2要求和IMO BWM.2/Circ.42 ：2020 的ANNEX 2：5的要 求进行样品采集。送检样本时，应提供样品采样时间、采样体积。样品在采样结束后 6h内完成分析。 7.1.2 在计数前，样品瓶盖应紧闭，颠倒摇动样品瓶 10次，以混匀样品。样品摇匀后立即进行计数。 样品计数 7.2 样品计数步骤如下： a) 从混合均匀的待测样品中取出 1 mL，转移至离心管（ 6.6）中，加入 2.5 μL浓度为5 μM/ mL 荧光素二乙酸酯 （ FDA）（5.1）、3.48 μL浓度为2.5 μM/mL 5-氯甲酸荧光素酯 （ CMFDA）（5.2）， 在涡旋混合器上震荡，避光染色 10min后，摇匀样品； b) 用移液枪（ 6.5）吸取上述 1 mL样品至1 mL浮游生物计数框（ 6.4）中； c) 在正置荧光显微镜（ 6.2）蓝色激发光道下观察 ，波长范围 450 nm～435 nm，物镜放大倍数 10×，计数大于等于 10 μm且小于50 μm活体生物数量； d) 如样本中 大于等于 10 μm且小于50 μm活体生物数量大于等于 1000个/ mL时，应检测 3个1 mL分样； e) 如样