ICS 65.020 CCS B 05 昭 DB5306 通 市 地 方 标 准 DB5306/T 78-2022 半夏组培快繁技术规程 2022-08-19 发布 2022-09-30 实施 昭通市市场监督管理局 发 布 DB5306/T 78-2022 前  言 本文件按照GB/T 1.1－2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由昭通市农业科学院提出。 本文件由昭通市农业农村局归口。 本文件起草单位：昭通市农业科学院。 本文件主要起草人：权申春、马永鹏、龙云星、高朝文、王茜、刘元剑、岳凯、宋贤武、李周、岳 万勇、李啟菊。 I DB5306/T 78-2022 半夏组培快繁技术规程 1 范围 本文件规定了半夏（Pinellia ternata (Thunb.) Breit.）组培快繁技术的术语和定义、生产及技 术流程、炼苗移栽、采收储藏操作规范。 本文件适用于半夏组培苗生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 317 白砂糖 GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 22278 良好实验室规范原则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 半夏一步成苗技术 将半夏（Pinellia ternata (Thunb.) Breit.）外植体接种于同一种培养基中，让外植体在其上脱 分化、再分化、长叶、生根，最终形成完整的植株。 3.2 超级原种 用半夏组培苗驯化繁殖产生的第一代繁殖材料（块茎、成熟珠芽、多块茎共生体）。 4 4.1 半夏组培快繁的生产及技术流程 组织培养生产设施设备 实验室应符合GB 19489和GB/T 22278要求。常用的实验设备有：超净工作台，高压蒸汽灭菌锅， 电子天平等。 4.2 培养基的配制方法 1 DB5306/T 78-2022 4.2.1 培养基配方 半夏组培快繁技术中所用培养基为MS + 6-BA + NAA+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH5.8。培养基配方详 细情况见附录A。 4.2.2 培养基配制程序 4.2.2.1 母液的配制和保存 试剂配制严格按照GB/T 603规定方法配制，所用水执行GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 标准。通常将常用试剂配制成比培养基所需浓度高10倍～100倍的母液，具体配制倍数见附录A。母液 置于2℃～4℃的冰箱中贮存。 4.2.2.2 植物生长调节剂的配制 植物生长调节剂用量极微量，各种植物生长调节剂单独配制。 4.2.2.2.1 NAA 的配制 精密称取 NAA 试剂，先用少量 95%乙醇或无水乙醇完全溶解，最后加水定容。常用母液浓度为 0.1mg/ml～1.0mg/ml。 4.2.2.2.2 6-BA 的配制 精密称取6-BA试剂，先用少量1mol/L的HCl完全溶解，最后加水定容。常用母液浓度为0.1mg/ml～ 2.0mg/ml。 4.2.2.3 培养基制备 半夏培养基由试剂、蔗糖、琼脂、水组成，蔗糖和水应分别符合GB 317和GB 5749规定。 培养基的制备：称取所需量的琼脂、蔗糖，根据不同浓缩倍数量取对应的母液；首先在水浴锅中加 入琼脂，搅拌让其慢慢熔化；再依次把量取好的母液及生长调剂加入已融化的琼脂中；最后加入蔗糖， 继续加温，不断搅拌，直至琼脂和蔗糖完全溶解；最终定容到所需体积。 4.2.2.4 pH 值调整 半夏培养基最佳pH值为5.8，采用酸度计或精密pH试纸测定调整，通常用1mol/L的NaOH或1mol/L 的HCl来调节。 4.2.2.5 培养基分装 配制好的培养基需趁热分装，分装量以培养容器体积的1/4～1/3为宜，分装后应立即密封。 4.2.2.6 培养基灭菌 培养基分装后应在24h内完成灭菌工作。在压力为1.1kg/cm2，温度121℃的条件下，灭菌25min～ 30min。 4.2.2.7 培养基保存 灭菌后的培养基应保存于洁净、干燥的培养基储存室中，2℃～4℃条件下7d内使用。 2 DB5306/T 78-2022 4.3 外植体的制备及接种 4.3.1 外植体的选择 无病虫害、健壮的半夏植株的叶片、珠芽、块茎均可作为外植体，以块茎为外植体更易于取样和操 作。 4.3.2 外植体的消毒 用块茎作为外植体时应先剥去表皮，外植体材料应先用自来水冲洗30min。将洗净后的外植体材料 转至超净工作台上，用75%乙醇浸泡10s～20s，用无菌水冲洗2次，再用0.1%升汞消毒8min～12min（块 茎、珠芽消毒12min；叶柄10min，叶片8min），最后用无菌水冲洗5次～7次后备用。 4.3.3 接种 在超净工作台上，将消毒好的半夏块茎切成约大小0.5cm×0.5cm，接种到培养基上，带茎尖的块茎 茎尖朝上摆放，切口接触培养基固定；叶柄切成1cm左右大小段扦插到培养基上；叶片切成大小 0.5cm×0.5cm、叶面朝上平铺于培养基上，接种后做好标记。半夏组培技术流程图见附录B。 4.4 初代培养 4.4.1 温度与光照 半夏最适宜的培养温度25℃±2℃，光照强度为1500Lx～2000Lx，光照时间为12h/d。 4.4.2 培养过程 接种好的培养瓶放置在条件适宜的培养架上，培养30d～50d左右，形成愈伤组织和丛生芽。丛生芽 和愈伤组织继续培养或者分割转接到新的培养基上，培养30d左右，形成完整组培苗。 4.5 增殖培养 4.5.1 叶片培养 将无菌组培苗浓绿厚大的叶片切成大小约0.5cm×0.5cm，叶面朝上平铺于培养基上，培养周期30d ～50d，形成愈伤组织和丛生芽。 4.5.2 叶柄培养 将无菌组培苗生长健壮的叶柄切成约1cm大小段，扦插于培养基上，培养周期30d～50d，形成愈伤 组织和丛生芽。 4.5.3 愈伤组织培养 将剪掉叶片和叶柄的愈伤组织分割成约大小0.5cm×0.5cm，转接到新的培养基上，培养周期30d左右， 形成完整的组培苗。 4.5.4 从生芽和愈伤组织培养 将丛生芽和愈伤组织继续培养或转接至新的培养基上，培养周期30d左右，形成完整组培苗。 3 DB5306/T 78-2022 5 设施驯化移栽操作规范 5.1 光照培养炼苗 在室温、自然光下，选择株高3cm～5cm的半夏组培苗，先拧松瓶盖2d～3d，再半揭瓶盖2d～3d， 最后完全揭开瓶盖，炼苗3d～5d后即可进行移栽。 5.2 移栽驯化 5.2.1 基质配制 在能调节光照、温度、湿度等因素的设施大棚内，将椰糠、蛭石、生物有机肥按体积7:2.5:0.5配制 成移栽驯化基质。 5.2.2 移栽 从瓶中取出经过光培炼苗的半夏组织苗，用自来水洗去附着的培养基，按株行距5cm×10cm移栽到 基质上，然后用薄膜覆盖保水保湿，在温度25℃左右，相对湿度85%条件下生长5d～7d揭摸。 5.3 苗期管理 5.3.1 肥水管理 由于组培苗比较脆弱，应根据天气情况及时做好管理，保持基质内含水量50％～60%。整个生长期 间保持温度25℃左右，遮阳率75%左右。待所有组培苗成活并长出新叶后，全面喷施第1次2000 倍水溶 复合肥（氮磷钾比列为12:8:30）；待多数叶片形成珠芽芽点时，全面喷施第 2 次 1000 倍水溶复合肥； 珠芽成熟过程中进行第三次800倍～1000倍水溶复合肥喷施。 5.3.2 病虫草害管理 病虫草害以预防为主，整个生育期及时除草，除小除早，严防草荒。主要病害有立枯病，主要虫害 有蚜虫和蓟马。半夏组培苗主要病虫害种类及防治方法见附录C。 5.4 采收与贮藏 5.4.1 5.4.1.1 采收 时间 驯化繁殖90d～120d左右，倒苗即可正常收获。 5.4.1.2 方法 收获前7d停止浇水。收获时先捡拾散落的珠芽，再按行开挖采收，最后用细筛将基质筛1遍，筛捡 漏收的。 5.4.2 储藏 将超级原种凉干水分后在4℃以下低温冷库中贮存；也可薄摊在通风阴凉的室内，适当加少量基质， 以保持水分，防止腐烂。 4 DB5306/T 78-2022 AA 附 录 A （规范性） 半夏组培快繁技术 MS 培养基配方 半夏组培快繁技术MS培养基配方见表A.1。 表 A.1 半夏组培快繁 MS 培养基配方表 编组 成分 名称 分子式 母液浓度 培养基母液 培养基剂量 （g/L） 用量/ml mg/L 药品相关标准 硝酸钾 KNO3 38.000 1900.000 GB/T647 大量元 硝酸铵 NH4NO3 33.000 1650.000 GB/T659 素 硫酸镁 MgSO4·7H2O 7.400 370.000 GB/T671 KH2PO4 3.400 170.000 GB/T1274 氯化钙 CaCl2 8.800 440.000 GB/T26520 铁盐 铁硫酸亚铁 FeSO4·7H2O 2.780 27.800 GB/T664 （100 乙二胺四乙 倍） 酸二钠 Na2-EDTA·2H2O 3.730 37.300 GB/T1401 硫酸锰 MnSO4·H2O 2.230 22.300 GB/T15899 硫酸锌 ZnSO4·7H2O 0.860 8.600 GB/T666 微量元 硫酸铜 CuSO4·5H20 0.0025 0.025 GB437 素 氯化钴 CoCl3·6H20 0.002 5 0.025 GB/T1270 (100倍) 钼酸钠 NaMoO4·2H2O 0.002 5 0. 250 （20倍） 磷酸二氢钾 有机物 (100倍) 50 10 10 碘化钾 KI 0.083 0.830 GB/T1272 硼酸 H3BO3 0.620 6.200 GB/T628 肌醇 10.000 100.000 盐酸硫胺素 0.010 0.100 盐酸吡哆素 0.050 烟酸 0.050 0.500 甘氨酸 0.200 2.000 10 0.500 蔗糖 30000 琼脂 6000 PH 5.8 以上试剂均达到化学纯级别以上 5