ICS 65.020.30 B 41 备案号：31115-2011 辽 宁 DB21 省 地 方 标 准 DB21/T 1888—2011 鸡传染性支气管炎诊断技术规程 Diagnostic techniques procedures for Avian Infectious Bronchitis 2011 - 01 - 17 发布 辽宁省质量技术监督局 2011 - 02 - 10 实施 发 布 DB21/T 1888—2011 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则并起草。 本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。 本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。 本标准主要起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。 本标准起草人： 李清竹、薛树山、顾贵波、王竹、段亚良、李井春、马君敏、邓文超、郑红玲。 I DB21/T 1888—2011 鸡传染性支气管炎诊断技术规程 1 范围 本标准规定了鸡传染性支气管炎病毒的病原分离、微量血凝抑制试验、琼脂凝胶免疫扩散试验、 RT-PCR诊断方法 本标准适用于辽宁省境内的鸡传染性支气管炎诊断、流行病学普查和检疫。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T GB/T GB/T NY/T 3 18935-2003 19438.1-2004 23197-2008 541-2002 口蹄疫诊断技术标准 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法标准 鸡传染性支气管炎诊断技术标准 动物疫病实验室检验采样方法 临床诊断 3.1 临床症状 由于病毒的组织嗜性不同，临床症状表现出一定差异。根据病毒感染鸡只所表现临床症状的不同， 可将鸡传染性支气管炎分为以下致病型： a) 呼吸型： 临床突然发生，并迅速传播全群。5 周龄以下病雏表现明显，伸颈，张口呼吸，啰 音、咳嗽、喷嚏和甩鼻。6 周龄以上鸡症状较轻。突出症状是气管啰音、气喘、呼吸困难。 b) 肾型：表现为肾炎、肠炎，并伴有呼吸道症状。发病 2d～3d 开始死亡，经 6d～11d 达死亡高 峰。病鸡死亡率在 30%左右。 c) 腺胃型：病死鸡表现为肠炎、严重脱水、极度消瘦。多伴有呼吸道症状。 d) 肠型：主要表现为脱水症状为主，伴有呼吸道症状。 e) 输卵管炎型： 产蛋鸡主要表现为卵巢及输卵管发炎而引起产蛋量显著下降，并在较长时间内 出现软壳蛋、畸型和粗壳蛋；蛋质变差，蛋白稀薄呈水样，蛋黄与蛋白分开及蛋白粘附在壳膜 上。产蛋鸡有程度不同呼吸道症状。 3.2 剖检病变 a) b) 呼吸型：鼻窦、气管、支气管粘膜肿胀，呈浆液卡他性炎。喉头、气管内有灰白色或灰黄色粘 液。肺充血、淤血和水肿，或有小灶性肺炎。 肾型：剖检时肾脏肿大，表面及实质有大量尿酸盐沉积，有时可见到输尿管内尿酸盐形成的结 石。 1 DB21/T 1888—2011 c) d) e) 4 腺胃型：剖检时腺胃肿大，呈球状，腺胃壁增厚，粘膜出血溃疡，胸腺，胰腺和法氏囊明显萎 缩。 肠型：剖检时气管粘膜出血肿胀，肾脏尿酸盐沉积，肠道粘膜肥厚，充血，盲肠扁桃体出血。 输卵管炎型：产卵母鸡卵泡充血，出血，变形，腹腔内有液关卵黄和腹膜炎。18 日龄以内的 雏鸡输卵管断裂、萎缩或局限性增生，以致造成永久性不能产卵。 实验室诊断 4.1 病原分离与鉴定 4.1.1 采样 急性呼吸道型的病鸡采取气管，刚扑杀的病鸡采取支气管和肺组织。肾型和产蛋下降型的病鸡采取 病肾或输卵管，若分离病毒应采取大肠、扁桃体、或粪便。 4.1.2 样品处理 4.1.2.1 将病料放在含有青霉素（10000IU/mL）和链霉素（10mg/mL）pH 值为 7 的磷酸盐缓冲盐水内， 置冰盒中发送到实验室。 4.1.2.2 将病料研磨，加含抗菌素的 PBS 制成体积分数为 20%的组织悬液，冻融 3 次，以 3000g 离心 20min，取上清液，加入终浓度为 1000IU/mL 的青霉素和终浓度为 1mg/mL 的链霉素，37℃下作用 1h 后 用于鸡胚接种。 4.1.3 分离培养 4.1.3.1 取病料上清液，接种于 5 枚 9 日龄的 SPF 鸡胚尿囊腔内，在取 5 枚接种 PBS，接种量均为 0.2mL/ 枚。37℃孵育。每天照蛋，24h 内死亡的鸡胚弃去。收集接种后 3d-7d 的鸡胚尿囊液，将所有尿囊液混 合，用含 1000IU/mL 青霉素和 1mg/mL 链霉素的 PBS 稀释 5 倍-10 倍，继续在鸡胚内传代。典型的毒株 通常在鸡胚中传至第 2 代或第 3 代时，可见侏儒胚，传至第 3 代，某些鸡胚可出现死亡。 4.1.3.2 将分离物经鸡胚传至 3 代或 3 代以上，收获接种后 7 天仍存活的鸡胚，取胎儿，用剪刀剪除 胎儿体外的附属物，并用吸水纸吸干胎儿表面的液体。如接种胎儿重量比对照胚最轻胎儿重量少 2g 以 上者，可初步判定为有病毒感染。 4.1.3.3 对病毒的进一步鉴定可通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）进行。 4.2 血清学诊断 4.2.1 微量血凝抑制试验（按照 GB/T23197-2008） 4.2.2 气管环组织培养血清中和试验（按照 GB/T23197-2008） 4.2.3 酶联免疫吸附试验 ELISA 试验是一种最敏感的血清学方法，可用于鸡群免疫后抗体的检测。已 有商品试剂盒出售，应严格按照说明书使用。 4.2.4 琼脂凝胶免疫扩散试验 4.2.4.1 材料准备 4.2.4.1.1 器材 2 DB21/T 1888—2011 a) b) c) d) e) 烧杯 直径 85mm 培养皿 孔径 4mm 的打孔器 6 号-9 号针头 微量移液器及吸头 4.2.4.1.2 琼脂扩散抗原 4.2.4.1.3 标准阳性血清 4.2.4.1.4 被检血清 无菌采血，分离血清（），4℃或–20℃保存备用 4.2.4.1.5 琼脂平板 配制方法见附录A（规范性附录）。 4.2.4.2 操作方法 4.2.4.2.1 琼脂板打孔 在琼脂糖平皿上，按坐标纸上画好的梅花型（见图1）打孔，孔径4mm，孔间距3mm，挑出孔内琼脂， 在火焰上封底。 ① ⑥ ② ⑦ ⑤ ③ ④ 图 1 打孔样式 4.2.4.2.2 加样 用微量移液器加样，7孔（中央孔）加抗原，1、3、5孔加标准阳性血清，2、4、6孔加待检血清， 每孔均以加满不溢出为度。 4.2.4.2.3 反应 加样完毕后，静置10min，放人37℃带盖的湿盒中反应，分别在12h、24h、36h观察并记录结果。 4.2.4.3 结果判定 4.2.4.3.1 判定方法 将琼脂板置暗背景或强光照射下观察。标准阳性血清孔与抗原孔之间出现一条清晰的沉淀线，则试 验成立；若无沉淀线或沉淀线不明显，则试验不成立，应重做。 3 DB21/T 1888—2011 4.2.4.3.2 判定标准 a) b) c) d) 被检样品孔与中央孔之间形成清晰的沉淀线，并与标准阳性血清孔的沉淀线相融合者，为阳性。 被检血清孔与抗原之间不形成完整的沉淀线，但标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线末端向 被检血清孔的内侧弯曲者，为弱阳性。 被检血清孔与抗原之间无沉淀线，标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线直伸向被检血清孔的 边沿无弯曲者，判为阴性。 有的被检血清与抗原之间可能出现两条以上沉淀线，其中一条与标准阳性血清一抗原间沉淀线 融合者判为阳性；均不融合者为阴性，此沉淀线为非特异性沉淀线。 4.3 RT-PCR 诊断 4.3.1 材料 4.3.1.1 样品的采集与处理 无菌采集病鸡的肺、气管粘膜，保持4—8℃环境尽快送往检测单位。在无菌室内将样品充分研磨， 并加入0.04mol/LPBS(pH7.4)(配置见资料性附录B)制成1：5悬液，3000g离心10min，取上清液备用。阳 性对照可选用新支二联活疫苗。 4.3.1.2 试剂及引物 a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l) Taq DNA 聚合酶、 AMV 反转录酶、 dNTP、 DL2000 DNA Marker、 琼脂糖、 核酸提取试剂 Trizol、 氯仿、 异丙醇、 DEPC 水(配置见附录 B)、 d dH2O、 75%乙醇溶液(配置见资料性附录 B）。 引物：特异性引物序列为上游 5'CACAGA AGT ATT TGA CCC CTT TGA3'；下游 5' CCG TTC TTA GGA AAC TCG TTG ACA 3'。目的片段大小为 314bp。 4.3.2 方法 4.3.2.1 样品总 RNA 的提取 4.3.2.1.1 阳性对照与样品同时提取 RNA，实验应使用 DEPC 水作为阴性对照。 4.3.2.1.2 取上清液 250μL 加入用 DEPC 水处理过的 1.5mL 离心管中，加入 750μLTrizol 病毒裂解液， 颠倒混匀。 4.3.2.1.3 室温（24℃）静置 5min，加入 200μL 氯仿，混匀。 4.3.2.1.4 静置 2min ，4℃12000g 离心 10min。 4 DB21/T 1888—2011 4.3.2.1.5 小心吸取上清液加入另一干净的用 DEPC 水处理过的 1.5mL 离心管中，再加入等体积的异丙 醇，混匀。 4.3.2.1.6 静置 5min ，4℃12000 转离心 10min。 4.3.2.1.7 小心倒掉上清液，加入 1000μL75%的乙醇溶液（用 DEPC 水配制，见资料性附录 B）； 4℃13000g 离心 2min。 4.3.2.1.8 小心倒掉上清液，置 37℃温箱 5min。 4.3.2.1.9 加 40μLDEPC 水溶解-70℃保存。 4.3.2.2 RT 反应 在0.2mlPCR管中配制如下体系： 1μL 1μL 1μL 上游引物 下游引物 RNA 模板 5×Buffer（反转录酶） 2μL dNTP（10mM） RNA 酶抑制剂 1μL 0.5μL AMV 反转录酶 0.5μL DEPC 水 3μL 注：以上体系置于42℃反应1h，在冰浴2min。 4.3.2.3 PCR 反应 在0.2mLPCR管中配制如下体系： cDNA 2μL 2+ 10×PCR Buffer（Mg Free） 2.5μL dNTP Mixture（各 2.5mM） 2μL 1μL 1μL 上游引物 下游引物 MgCI2 1μL rTaq DNA 聚合酶 0.25μL ddH2O 15.25μL 以上体系按下列程序在 PCR 仪