ICS 65.020.30 B 43 备案号：48513-2016 青 海 DB63 省 地 方 标 准 DB 63/T 1436—2015 藏羊细管冷冻精液生产技术规程 2015-12-21 发布 2016-03-20 实施 青海省质量技术监督局发 布 DB63/T 1436—2015 前 言 本规程的编写符合GB/T 1.1-2009的规则。 本规程由青海省农牧厅提出并归口。 本规程起草单位：青海省家畜改良中心。 本规程主要起草人：马元梅、张晋青、胡宁玺、常永梅、莫延新、赵静、袁海洲、张子安、谢秀梅、 李强、张金梅、杨玉芹、扈添琴、王芳、李景、池胜刚、谭建宁。 I DB63/T 1436—2015 藏羊细管冷冻精液生产技术规程 1 范围 本规程规定了欧拉型、高原型、山谷型藏羊细管冻精生产的基本要求、稀释液配制、采精、精液处 理、精液冷冻、冻精活力检验规则和方法、冻精质量评价、冻精包装、标记和贮存等。 本规程适用于藏羊的细管冷冻精液的生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4143 牛冷冻精液 GB/T 5458 液氮生物容器 NY/T 1234 牛冷冻精液生产技术规程 3 术语与定义 以下术语和定义适用于本规程。 3.1 采精 用人工模拟的器械获得公羊精液的方法。 3.2 采精量 公羊一次采精时排出的精液量。 3.3 鲜精 未经处理的新鲜精液。 3.4 精子密度 每单位体积精液中的精子数目。单位为亿每毫升。 3.5 1 DB63/T 1436—2015 细管冷冻精液 细管注入精液经液氮冷冻所形成的产品。简称“细管精液”或“冻精”。 4 采精前的准备 4.1 冻精制作室的要求 室内清洁卫生，做到无菌操作。 4.2 仪器设备 4.2.1 生产设备 用于藏羊细管冷冻精液生产的仪器设备见表1。 表1 序号 藏羊细管冷冻精液生产设备 设备名称 参数 1 精液细管喷码机 2 ACCUCELL 精液密度仪 0.21 毫升～0.23 毫升 3 细管封装机 5 250 支×0.25 毫升 4 精液程控冷冻仪 45 ℃～-140 ℃ 5 电子天平 0.0 001 克 4.2.2 检验设备 用于藏羊细管冷冻精液质量检验的设备见表2。 表2 序号 藏羊细管冷冻精液质量检验设备 设备名称 参数 1 相差显微镜 100 倍～400 倍 2 恒温恒湿培养箱 ±0.5 ℃ 3 净化工作台 菌落数≤0.5 个每皿每小时 4 数显恒温水浴锅 ±0.5 ℃ 5 电热高压灭菌锅 0 Mpa～0.25 Mpa 4.3 器械清洗和消毒 器械的清洗与消毒按照NY/T 1234进行。 4.4 稀释液的配制 稀释液的配制按照附录A进行。 5 采精 2 DB63/T 1436—2015 5.1 采精环境要求 采精场所应保持安静，地面平整，清洁卫生，采精前做彻底消毒。 5.2 藏羊种公羊选用 用于冻精生产的种公羊应符合本品种标准，体质健壮，无遗传缺陷及国家规定的传染病。 5.3 采精频率 12月龄初次调教采精。 成年种公羊每周可采精3天，每天连续采精两次。 5.4 采精方法 5.4.1 台羊选择 选择发情好的健康母羊作台羊，头部固定在采精架上。 5.4.2 假阴道的准备 将消毒过的假阴道内胎，用生理盐水棉球从里到外擦试，在假阴道一端扣上集精瓶，集精瓶夹层内 要注入30 ℃～35 ℃的水。在假阴道外壳中部注水孔注入145毫升～150毫升的50 ℃～55 ℃水，拧上气 嘴活塞，套上双连球打气，使假阴道的采精口形成丫字形。最后把温度计插入假阴道内测温，温度在38 ℃～40 ℃为宜。在假阴道内胎的前1/3，涂抹适量凡士林作润滑剂。 5.4.3 采精操作 采精前，将公羊包皮周围及母台羊后躯擦干净。采精员蹲在台羊右侧后方，右手握假阴道，气卡塞 向下，靠在台羊臀部，假阴道和地面呈35°角。当公羊爬跨伸出阴茎时，左手轻托阴茎包皮，迅速地将 阴茎导入假阴道内，当种公羊完成抬头、挺腰、前冲动作时，表示射精完毕。随着公羊从台羊身上滑下 时，将假阴道取下，立即使集精瓶的一端向下坚立，打开气卡塞，放气取下集精瓶，送操作室检查。 6 冻精制作 6.1 准备 生产冻精所用精液应符合本规程7.1的要求。玻璃器皿均应放在32 ℃恒温箱中，稀释液放在34 ℃ 恒温水浴箱中备用。盛装稀释精液的稀释管，应做明显标记。 6.2 6.2.1 精液的稀释与平衡 精液稀释量确定和活力评定 根据鲜精液的密度、活力、采精量等确定应加的稀释液量，确保每剂冻精所含直线前进运动精子数 的要求。精液稀释后和平衡后应评定活力。 6.2.2 稀释方法与平衡 按附录 A 配制稀释液，采用二步稀释法稀释精液。用 34 ℃的第Ⅰ液缓慢地加入精液中，摇匀，所 加第Ⅰ液的量为所加稀释液总量与精液量总和的一半减去精液量，用烧杯盛适量的 34 ℃水，把稀释管 放置于送 4 ℃~5 ℃低温柜内降温，与此同时把第Ⅱ液也放入。稀释后的精液，采用逐渐降温法。在 1 小时，使稀释精液的温度降到 4 ℃～5 ℃后，然后再在同温的恒温容器内平衡 1 小时～2 小时。冷冻前 3 DB63/T 1436—2015 半小时加入第Ⅱ液，所加第Ⅱ液的量为所加稀释液总量减去所加第Ⅰ液的量。加入第Ⅱ液后平衡半小时， 然后在低温柜中进行细管分装，分装后的细管即可进行冷冻。 6.3 细管的封装与冷冻 6.3.1 细管要求 细管为无毒、耐低温的专用塑料管。0.25 毫升剂型。保证清洁、无菌。 6.3.2 封装 采用细管（灌装、封口、印字）一体机，在4 ℃低温柜中进行分装操作。 6.3.3 细管标识 细管标识清楚，内容为冻精产地、品种及羊号、冻精生产日期。 6.3.4 细管精液的冷冻 封装好的细管即可通过程控冷冻仪或自制冷冻槽冷冻。 6.3.4.1 程控冷冻仪冷冻 采用程控冷冻仪按预选的最佳冷冻曲线自动完成冷冻过程。冷冻曲线最佳降温速率为：4 ℃～-10 ℃ （降温速率5 ℃/min ），-10 ℃～-100 ℃（降温速率55 ℃/min），-100 ℃～-140 ℃（降温速率20 ℃/min）。冷冻时间7分钟。 6.3.4.2 自制冷冻槽冷冻 用自制冷冻槽冷冻细管时，冷冻温度控制-100 ℃～-140 ℃。冷冻时间8分钟。 6.4 冻精收集 每冻完一批（只）精液，应立即放入液氮中浸泡，然后计数，取样检查和包装。 6.5 冻精解冻与活力检查 冷冻后的精液可在任一时间进行解冻。解冻时，预先把水浴锅水温加热至38 ℃～40 ℃，用镊子取 一支冷冻后的细管精液迅速浸泡入水中并晃动，待溶解后立即取出，用吸水纸或纱布擦干水珠，再用细 管剪减去超声波封口端，滴5微升～10微升精液于载玻片上进行活力检查。检查方法同6.4。检查合格的 冻精作为初检合格品妥善贮存。 7 精液要求及试验方法 7.1 鲜精质量要求及试验方法 用于藏羊细管冷冻精液生产的鲜精质量应符合表3的要求。有一项不符合的精液，不得用于冻精生 产。 4 DB63/T 1436—2015 表3 序号 项目 鲜精质量指标 质量指标 试验方法 为乳白色或微黄，略有腥味。 自然光下目测。 1 外观 2 精子活力（%） ≥ 65 取精液 5 微升～10 微升于载玻片上，加盖盖玻片 后在 38 ℃恒温装置的 400 倍显微镜上评定活力。 3 精子密度（亿/毫升）≥ 7.2 15 用密度仪测定。 冻精质量要求及试验方法 7.2.1 检验规则 每只公羊每季度冻精型式检验不少于一次。 出站检验的项目：外观、精子活力。检验合格，可作为合格品交付使用。 7.2.2 冻精质量评价 藏羊细管冷冻精液质量应符合表4的要求。 表4 序号 项目 1 细管外观 2 剂量（毫升） 3 精子活力（%） 4 冻精质量指标 质量指标 试验方法 细管无裂痕、两端封口严实。 目测。 ≥ 0.18 按照 GB 4143 中 B.2 测定。 ≥ 35 按照 GB 4143 中 B.3 测定。 前进运动精子数（万个） ≥ 2 000 按照 GB 4143 中 B.4 测定。 5 精子畸形率（%） ≤ 20 按照 GB 4143 中 B.5 测定。 6 精子顶体完整率（%） ≥ 45 按照 GB 4143 中 B.5 测定。 7 细菌数（个） ≤ 800 按照 GB 4143 中 B.6 测定。 7.2.3 冻精质量判定要求 每剂冻精解冻后应同时具备上列质量指标要求，不具备任何一项者，为冻精质量不合格。 8 8.1 包装、标记和贮存 包装 用无菌纱布袋包装，一指型管25剂细管，每袋包装量不超过200剂。包装操作应在液氮中进行。 8.2 标记 包装袋外面，均应有明显的标记。注明种公羊品种、公羊号、生产日期或批号、数量、精子活力。 8.3 贮存 用液氮生物容器贮存藏羊冻精，液氮生物容器应符合GB/T 5458要求。设专人保管，每周定时加一 次液氮，保证冻精始终浸在液氮中。应经常检查液氮生物容器的状况，如发现容器异常，立即将冻精转 5 DB63/T 1436—2015 移到其他完好的容器内。取存冻精时，冻精离开液氮的时间不得超过5秒。取放冻精之后，应及时盖好 容器塞，防止液氮蒸发或异物浸入。 6 DB63/T 1436—2015 AA 附 录 A （规范性附录） 稀释液的配制 A.1 试剂要求 配制冻精用的稀释保护剂，应用新鲜的双蒸馏水和卵黄，二级品以上的化学试剂。 A.2 器具要求 所用器具保证清洁、无菌。 A.3 稀释液配方 配方1：双蒸馏水100毫升，蔗糖3.7克，柠檬酸钠3.7克，果糖0.5克，三羟甲基氨基甲烷0.2克，甘 油5毫升，卵黄15%。 配方2：双蒸馏水100毫升，蔗糖3.7克，柠檬酸钠3.7克，果糖0.5克，三羟甲基氨基甲烷0.2克，5 毫升维生素B12，乙二醇5毫升，卵黄15%。 A.4 稀释液的配制 分基础液的配制、第Ⅰ液的配制和第Ⅱ液的配制： a) 基础液的配制：先准确称取蔗糖 3.7 克，柠檬酸钠 3.7 克，果糖 0.5 克，三羟甲基氨基甲烷 0.2 克，放入容器为 100 毫升的量筒内，加蒸馏水 50 毫升左右，用消毒过的玻璃棒搅拌，待 溶解后再加蒸馏水定容至 100 毫升，混匀后用滤纸过