ICS 65.020 B 62 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 2093—2014 蝴蝶兰组培苗快繁技术规程 Technical regulation for rapid propagation of phalaenopsis amabilis 文稿版次选择 2014 - 06 - 01 发布 安徽省质量技术监督局 2014 - 07 - 01 实施 发 布 DB34/T 2093—2014 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省农科院园艺研究所提出，由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省农科院园艺研究所、安徽省盆栽花卉工程研究中心。 本标准主要起草人：张金云、谢光坤、秦改花、束冰、王生旭、伊兴凯、潘海发、杨连信。 I DB34/T 2093—2014 蝴蝶兰组培苗快繁技术规程 1 范围 本标准规定了蝴蝶兰组培快繁的术语和定义、仪器设备、培养基、无菌操作、外植体的接种与转代、 组培苗分级、炼苗与移栽、出圃、包装、标识、运输。 本标准适用于蝴蝶兰的组培快繁。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 1.5 寸、2.5 寸、3.5 寸苗 目前市场上销售的蝴蝶兰种苗通常被业内分为 1.5 寸、2.5 寸和 3.5 寸三个规格，1 英寸＝2.54 cm，分别代表蝴蝶兰种苗栽植的容器的直径为 4 cm、6.5 cm 和 9 cm。 3 仪器设备 3.1 消毒设备 高压灭菌锅，水浴锅，医用小推车，专用托盘，微波炉等。 3.2 洗涤设备 洗瓶机，培养基自动定量灌装机，晾瓶架，毛刷等。 3.3 称量设备 电子精密天平，电子天平等。 3.4 中央实验室设备 中央实验台，试剂架，试验台，试剂柜，光照培养箱，边台实验台等。 3.5 接种室设备 接种箱或超净工作台，接种专用工作服，接种用专用盘，解剖刀，口罩，鞋套，专用记号笔，脱脂 棉/脱脂纱布，紫外线杀菌灯等。 3.6 培养室设备 高效节能培养架，光谱灯，紫外线杀菌灯，温湿度计，程控定时器，组培筐，生化培养箱，三角烧 瓶，烧杯，量筒，组培瓶，组培盖或封口膜，棉线，长镊子，剪刀，容量瓶，移液管，牛皮纸等。 1 DB34/T 2093—2014 4 培养基 4.1 初代培养基 MS + 6-BA 3～5 mg/L + NAA 0.3～0.5 mg/L+ 蔗糖 20 g/L + 琼脂 7～8 g/L，pH 为 5.2～5.8。 植物生长调节剂根据蝴蝶兰品系品种的不同按需选择，常用的植物生长调节剂有 6-BA、Ad、IAA、 ZT 等，使用浓度因品系品种的不同而不同。 4.2 增殖培养基 MS + 6-BA 3.0～5.0 mg/L + NAA 0.3～0.5 mg/L + 蔗糖 20 g/L + 琼脂 7～8 g/L，pH 为 5.2～ 5.8。6-BA 少数品种需继续加大浓度。 4.3 壮苗培养基 MS + 蔗糖 20 g/L + 琼脂 7～8 g/L + 活性炭 1 g/L，pH 为 5.2～5.8。 4.4 生根培养基 MS + IBA 0.2 mg/L + NAA 0.1～0.2 mg/L + 蔗糖 15 g/L + 琼脂 7～8 g/L + 活性炭 1 g/L，pH 为 5.2～5.8。 5 无菌操作 5.1 培养基灭菌 将配好的培养基加入琼脂加热溶解，趁热分装于 100 ml 组培瓶中，每瓶约 30 ml。待培养基冷却 凝固后，盖上组培盖，或盖上封口膜并用棉线扎牢，然后在高压灭菌锅中 121℃下灭菌 20 min。取出 组培瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具如长镊子、解剖刀、剪刀等及灭菌水，需同 时灭菌。 5.2 外植体 5.2.1 外植体选择 蝴蝶兰组培快繁中采用花梗做外植体，花梗需成熟﹑健壮，通常带3 朵～6 朵花；花梗花朵无畸形、 无病虫害、无严重机械损伤、严重脱水等现象；花型花色完全符合本品种特性，花色均一、花朵排序整 齐。花梗在采切前需适当控水控肥和增强光照。 5.2.2 外植体建档 对采集好用于做外植体的花梗首先进行生产编号、病毒检测等，建立建全接种外植体的档案，如品 种正式登录名或别名、父母本登录名、品种来源、照片资料，育种者全名、植株规格、植株生长状况、 株型、花色包含排序、花朵大小、朵间距、花型描述、花色描述、花梗高度、花梗数量、叶幅大小、养 护难易及注意要点、催花难易及注意要点；组培各阶段表现包含诱导、增殖 1-N 代表现、壮苗生根、 定植。 5.2.3 外植体消毒 2 DB34/T 2093—2014 将采集的花梗保湿迅速带回实验室，切成 1 cm～2 cm 长的单芽茎段，用肥皂水洗两遍。在超净工 作台上将洗好的单芽茎段放在消毒的广口瓶内，加入 2 倍花梗体积的 5％双氧水进行表面消毒，消毒 时间为 20 min 左右，然后用无菌水冲洗 2 遍，随后将花梗夹于无菌纸上风干，用枪形镊剥除苞叶。 剥掉苞叶的花梗再放入一个无菌广口瓶中，加入花梗 2 倍体积的 0.1％升汞进行消毒，消毒过程中不 断摇晃瓶子，使消毒液充分接触花梗，消毒时间为 10 min 左右。然后再用无菌水冲洗 4 次，以彻底 冲洗掉外植体上残留的消毒液。最后将消完毒的花梗放在无菌滤纸上吸干多余的水分备用。 6 外植体的接种与转代 6.1 外植体的接种 在超净工作台上，用手术刀在芽上端 0.5 cm 处平切，芽下端 1.0 cm 处斜切以使芽体与培养基充 分接触，然后接入初代培养的培养基中，接种时需注意芽的方向。初代培养时每瓶不宜接种太多，以防 污染造成巨大损失，通常每瓶宜接种 2 个～3 个外植体。接种后，在瓶子的下角用记号笔标记接种材 料、培养基、操作人员的编号以及接种时间等信息。 6.1.1 初代培养条件 培养温度为 22 ±2℃。所使用的温度计都必须经过校正，每个温度计上都要标明校正值及温度范 围。培养前期 7 d～10 d 需暗培养，待有芽萌发后转入光下培养，光照强度为 1000 lx，光照时间 8 h/d～ 10 h/d。 6.2 转代 6.2.1 增殖培养 待芽长到 2.0 cm～3.0 cm，营养芽的两个叶片开始展开时，可进行增殖培养。增殖培养接种的密 度不宜过大或过小，密度过大，芽苗扩增的空间和营养受限，继代时间短，密度过小，使生产成本增加。 对于 500 mL 的培养甁，一般每瓶以接种 30 个左右的芽为宜。每次接种完后需在瓶子下方标记好接种 材料编号、继代次数、操作人员编号以及接种日期等信息。 6.2.1.1 增殖培养条件 培养温度为 25℃ ± 2℃，光照强度 1500 lx，光照时间 10 h/d～12 h/d。 6.2.2 壮苗培养 切去芽丛基部褐化组织以及老叶和黄化叶，剔除变异苗包括玻璃花苗﹑莲座体﹑双叶脉﹑叶片畸形 等，将 1.0 cm 以上的芽苗分成单株进行壮苗培养。 6.2.2.1 壮苗培养条件 培养温度 25℃ ± 2℃，光照强度 1500 lx，光照时间 12 h/d～14 h/d。 6.3 生根 6.3.1 生根培养 进一步剔除变异苗包括玻璃花苗﹑莲座体﹑双叶脉﹑叶片畸形等以及细弱苗。筛选生长健壮、长势 一致的无根苗进行生根培养。 3 DB34/T 2093—2014 用于生根培养的芽苗一般茎段长度为 1.5 cm 左右，叶长 2.5 cm 左右。 具体方法为：去除褐化组织及老化、黄化的叶片，以及褐化组织，叶基部如有与茎段脱离的苞叶， 则将该苞叶去除干净。 操作过程中严禁伤到需保留的叶片。 6.3.2 生根培养条件 培养温度为 25℃ ± 2℃，光照强度 1500 lx，光照时间 8 h/d。 7 组培苗分级 根据叶片颜色深绿、浅绿、叶片张开幅度等，结合苗高，生产中可将蝴蝶兰组培种苗分为小苗、中 苗、大苗和等外级即不合格苗，通常小苗苗高 2.5 cm～3 cm，中苗苗高 3 cm～4 cm，大苗苗高 4 cm 以上，2.5 cm 以下的为等外级苗。 8 炼苗与移栽 8.1 炼苗 当组培种苗苗高 2.5 cm～4 cm，具有 3 片～4 片叶和 2 条～3 条根时，便可移栽。为了保证其 成活率，常在瓶苗出瓶以前，先在炼苗大棚内把培养瓶盖全部打开或半打开，打开时间为培养基不发霉 为止。一般为 7 d 左右。 8.2 出瓶 经炼苗后，用镊子将组培苗从培养基中取出，放在托盘中，洗掉基部培养基和枯叶，在大棚内或温 室中栽植于苔鲜中。 环境的昼夜温度分别是 25℃～29℃和 22℃～24℃。相对湿度保持在 80％～90％；移栽初期 20 d 内光照强度控制在 2000 lx～3000 lx，45 d 后光照强度控制在 6000 lx～8000 lx，90 d 后光照强度 控制在 10000 lx～20000 lx，小苗出瓶 5 d 后可开始喷施叶面肥，可喷施兰花专用叶面肥，每 5 d 喷 施一次，20 d 后施第一次肥料，施用肥料 N:P:K=20：20：20，浓度为 3000 倍～4000 倍灌根，施肥 次数为每隔 10 d～15 d 一次。 9 出圃 9.1 小苗出圃 组培苗出瓶后，栽种在直径 4 cm 的塑料透明营养袋中，经过 4 个～5 个月，小苗长至两叶距 10 cm～15 cm，叶宽 4 cm～5 cm，叶数 4 片～5 片，叶子肥厚，叶片坚挺，叶色浓绿，叶片间已开始互 相遮挡；根系较密集，有些盘旋于盆底，并有部分已长出盆外，此时为小苗俗称 1.5 寸苗可出圃。 9.2 中苗出圃 小苗经换盆，栽种在直径 6.5 cm 的塑料透明营养袋中，约 6 个～7 个月，长至两叶距 16 cm～ 22 cm，叶宽 4 cm～6 cm，叶片数 4 片～6 片，叶片肥厚，挺立，叶色浓绿，叶片开始互相遮挡。 盆中根系已达盆底，有部分根已长出盆外，此时为中苗俗称 2.5 寸苗可出圃。 4 DB34/T 2093—2014 9.3 大苗出圃 中苗经换盆，栽种在直径 9 cm 的塑料透明营养袋中，经过 4 个～5 个月，两叶距 28 cm～35 cm， 叶宽 8 cm～10 cm，叶数 4 片～6 片，叶色浓绿，叶片肥厚挺立，单轴茎较饱满。 盆中根系已基本饱满，根系粗壮有活力，此时为大苗俗称 3.5 寸苗可出圃。 10 包装、标识、运输 10.1 小苗包装 用 92.5 cm × 31.5 cm × 12 cm 开孔纸盒作内包装，用 95 cm × 32.5 cm × 65 cm 开孔纸箱作 外包装，每盒 150 株。每箱 5 盒共 750 株。包装方法可将小苗竖直摆放并让叶片按对角线排列于纸 盒中，一盆挨一盆摆放，最后在上面盖上一层软纸后封箱。 10.2 中苗包装 用 92.