ICS 07.080 B 16 福 DB35 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1883—2019 无斑玛瑙螺检疫鉴定方法 Detection and identification of Achatina immaculata (Lamarck, 1822) 2019 - 12 - 19 发布 福建省市场监督管理局 2020 - 03 - 19 实施 发 布 DB35/T 1883—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 无斑玛瑙螺基本信息 ................................................................ 2 5 鉴定依据 .......................................................................... 2 6 器具与试剂 ........................................................................ 2 7 现场检疫 .......................................................................... 2 8 实验室鉴定 ........................................................................ 3 9 结果评定 .......................................................................... 3 10 标本处理和保存 ................................................................... 4 附录 A（资料性附录） 无斑玛瑙螺寄主、地理分布及危害性 ................................ 5 附录 B（资料性附录） 无斑玛瑙螺与近似种的鉴别特征比较、成螺形态特征及分子生物学鉴定方法 ..................................................................................... 6 I DB35/T 1883—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由福州海关提出并归口。 本标准起草单位：福州海关。 本标准主要起草人：王沛、胡美玲、周卫川、林阳武。 II DB35/T 1883—2019 无斑玛瑙螺检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了无斑玛瑙螺[Achatina immaculata (Lamarck,1822)]的检疫鉴定方法。 本标准适用于无斑玛瑙螺的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注文件的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 3067—2011 软体动物常规检疫规范 3 术语和定义 SN/T 3067—2011界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 体螺层 body whorl 贝壳的最后一个螺层。 注：体螺层一般较大，容纳动物的头部和足部。 3.2 壳顶 apex 螺旋部顶端。 注：壳顶是动物最早的胚壳，其形状有钝圆、尖锐、扁平等，有些种类的壳顶常被腐蚀磨损。 3.3 壳口 aperture 体螺层末端的开口。 注：壳口为动物头和足的出口。 3.4 口唇 lip 壳口的边缘。 注：口唇按其在壳口的位置不同可分为内唇、外唇、轴唇、上唇和下唇。 3.5 脐孔 umbilicus 贝壳旋转时在末端遗留下的一个小窝。 注：有些贝壳的脐孔封闭或被遮盖。 1 DB35/T 1883—2019 3.6 COI基因 cytochrome oxidase subunit I gene 线粒体细胞色素C氧化酶亚基I。 注：该基因常被应用于系统发育和DNA条形码研究，是软体动物DNA条形码的靶标基因，广泛应用于软体动物的分子 鉴定。 4 无斑玛瑙螺基本信息 以下列出无斑玛瑙螺的基本信息，其他信息参见附录A。 中文名：无斑玛瑙螺。 英文名：Pink-lipped agate snail。 学名：Achatina immaculata (Lamarck, 1822)。 分 类 地 位 ： 软 体 动 物 门 (Mollusca) ， 腹 足 纲 (Gastropoda) ， 肺 螺 亚 纲 (Pulmonata) ， 柄 眼 目 (Stylommatopgora)，玛瑙螺科(Achatinidae)，玛瑙螺属(Achatina)。无斑玛瑙螺的近似种主要有非洲 大蜗牛(A. fulica Bowdich, 1822)和虎斑玛瑙螺[A. achatina (Linnaeus, 1758)]（参见附录B中的表 B.1）。 5 鉴定依据 传播方式和传播途径是确定现场检疫的依据。贝壳、螺体形态特征和分子生物学特性是实验室鉴定 的依据。 6 器具与试剂 6.1 器具 体视显微镜、放大镜、手电筒、塑料自封袋、广口标本瓶、4 mm孔径土壤筛、小铁铲、游标卡尺、 白瓷盘、培养皿、镊子、剪刀、显微镊子、显微剪刀、微针、解剖腊盘、标签、移液枪、微型离心机、 PCR仪、1.5 ml离心管、0.2 ml PCR反应管、恒温金属浴、低温冰箱。 6.2 试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。 75%乙醇、无水乙醇、硫酸镁、动物基因组DNA提取试剂盒、PCR Master Mix、ddH2O。 7 现场检疫 7.1 仔细观察来自疫区的运输工具的底部和四角部位以及所装货物与木质包装材料是否有蜗牛，尤其 要注意阴暗蔽光处，对可能被蜗牛污染的物品可用高压水枪冲洗后再检查。对来自疫区的原木、盆景、 苗木、水果等未经加工的植物性原材料也应认真检查。发现蜗牛，随时装入塑料自封袋或标本瓶带回实 验室做进一步的检验鉴定（参见附录 A）。 7.2 蜗牛爬行过后，一般都会留下银灰色的丝带状黏液痕迹，这是判定是否有蜗牛污染的重要依据。 发现盆景等携带土壤或其它细碎衬垫材料时，应过筛检查是否有卵或幼螺。 2 DB35/T 1883—2019 8 实验室鉴定 8.1 测量、观察和饲养 用游标卡尺测量蜗牛贝壳的壳高和壳宽。用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察螺的形态特征，例 如壳顶、螺纹、壳口、脐孔等。单独查获的卵粒和幼螺，按照SN/T 3067—2011中8.4方法，将其孵化和 饲养为成螺后，再做鉴定。 8.2 玛瑙螺属鉴定特征 贝壳呈长卵圆形，具有圆锥形的螺旋部，胚螺层2～3个，小，圆锥形，光滑；壳口呈卵圆形。壳轴 下面呈截断状。肺相当粗壮，肺脉管无大的分枝，但具有稠密的侧枝；颚片具有稠密的螺纹；齿舌中板 窄，侧板具有大的尖角，并有一外齿尖。在缘齿上无特殊的内齿尖。阴茎无独特的鞘。牵引肌是一条右 触角肌。 8.3 无斑玛瑙螺鉴定特征 8.3.1 卵 卵粒圆形或椭圆形，长4.5 mm～6.5 mm，宽4.0 mm～5.0 mm，乳白色，稍硬，珍珠般光泽。 8.3.2 8.3.2.1 贝壳 成螺 贝壳大型，壳高100 mm～165 mm，壳宽 40 mm～85 mm。右旋，长圆锥状，壳质厚，坚实，表面分 布少量短而弯曲的、轴向排列的沟槽。贝壳螺旋部高，壳顶钝圆，胚螺层光滑，随着个体的生长逐渐变 白。螺层7～9个，各螺层圆凸，壳表为棕黄色或灰白色，大部分有深棕色至暗红褐色的纵向略直条纹。 刻纹粗，靠近缝合线处不规则且略呈齿状。螺纹稠密，与略弯曲的沟槽交叉。体螺层膨大，表面粗糙， 内层表壳灰白色。壳口宽，简单，锋利，易碎，为卵圆形。口唇外唇不增厚，不外折，内唇贴覆于体螺 层上，形成粉红色的薄胼胝部。壳口内唇、外唇内侧和螺轴均为粉红色，无脐孔（参见附录B中的B.2）。 8.3.2.2 幼螺 幼螺贝壳外形与成螺相似，但个体小，壳质薄，易碎，且无弯曲粗大的纵向条纹。 8.3.3 螺体 螺体足部肌肉发达，一般为黑褐色，背面呈暗棕黑色，蹠面呈灰黄色，成螺时则转灰白色，粘液无 色。 8.3.4 分子生物学鉴定 参照附录B中的B.3方法提取DNA、PCR扩增和测序，将所测序列与Genbank登录号为MH898869已知无 斑玛瑙螺的COI基因序列进行比对，一致性宜≥95%。 9 结果评定 以贝壳形态为基本鉴定依据，螺体形态为辅助鉴定特征，并注意与近似种鉴别，符合8.3.2或同时 符合8.3.3形态特征的蜗牛鉴定为无斑玛瑙螺。单独查获的卵粒符合8.3.1形态特征，应通过孵化和饲养 3 DB35/T 1883—2019 实验（参见SN/T 3067—2011中8.4），做进一步的鉴定。符合8.3.4作为前期初筛或最终鉴定结果的分 子佐证。 10 标本处理和保存 10.1 标本处理 10.1.1 闷杀 将蜗牛置于盛满水的瓶中，盖上瓶盖，蜗牛在慢慢窒息的过程中逐渐伸展身体死亡；或在盛水的瓶 中逐渐加入少量硫酸镁，进行麻醉闷杀。 10.1.2 固定和保存 将闷杀后软体伸展的蜗牛标本置于75%的乙醇溶液中固定，每隔1 d～2 d换1次乙醇溶液，共换3～ 4次，便可长期保存于75%的乙醇溶液中。对于鉴定为无斑玛瑙螺的样品则置于无水乙醇溶液中，在 -70 ℃～-20 ℃的低温下长期保存。 10.2 标本保存 经处理后的标本，至少妥善保存6个月，并注明时间、产地、寄主、采集人等信息。 4 DB35/T 1883—2019 B A 附 录 A （资料性附录） 无斑玛瑙螺寄主、地理分布及危害性 A.1 寄主 无斑玛瑙螺寄主植物达500种，包括草本