ICS 65.020.20 B 05 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1940—2020 西部沙樱组织培养技术规程 Technical Regulation for Tissue Culture of Prunus pumila 2020-07-30 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2020-08-30 实施 发 布 DB15/T 1940—2020 前 言 本标准按照GB/T1.1-2020给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。 本标准起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古林业科学研究院。 本标准主要起草人：白玉娥、托亚、哈布尔、彭鹏、莎仁图雅、杨荣、宁静。 I DB15/T 1940—2020 西部沙樱组织培养技术规程 1 范围 本标准规定了西部沙樱组织培养育苗的术语和定义、环境道具消毒灭菌、培养基、外植体、初代培 养、增殖继代培养、生根培养、组培苗炼苗移栽等基本内容及技术要求。 本标准适用于利用西部沙樱组织培养技术生产苗木。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 LY/T 1882 林木组织培养育苗技术规程 DB15/T 1588 元宝枫组织培养育苗技术规程 3 术语和定义 LY/T 1882 和 DB15/T 1588界定的术语和定义适用于本文件。 4 环境器具消毒灭菌 4.1 洗涤室和接种室消毒 工作前或结束后，使用臭氧紫外灯照射1 h。 4.2 培养室消毒灭菌 每10 d使用臭氧紫外灯照射消毒2 h。如组培苗出现感染现象，应采用甲醛(HCHO，10 mL/m³)和高 锰酸钾(KMnO4，5 g/m³)混合薰蒸消毒，在密闭条件下熏蒸消毒20 min～30 min，消毒后要打开门窗通 风换气。 4.3 超净工作台消毒灭菌 接种前用臭氧紫外灯照射消毒至少30 min，并用70 %～75 %酒精喷洒消毒台面；定期清洗超净工作 台的过滤膜。 4.4 器具灭菌 4.4.1 接种器具灭菌 在1个接种台班结束后，使用器具流水冲洗，用锡箔纸包好，置于高压灭菌锅灭菌。接种工具使用 前，用酒精灯外焰灼烧20 s以上，或用接种工具灭菌器直接灭菌。 1 DB15/T 1940—2020 4.4.2 培养容器消毒灭菌 有污染的培养容器用高压灭菌锅消毒后，去除培养基，用流水冲洗残留培养基存放。 5 培养基 5.1 基本培养基 初代培养、增殖继代培养采用MS基本培养基，生根培养采用1/2 MS基本培养基。 5.2 母液和激素配制与保存 5.2.1 配制 培养基母液配制见附录A。激素均配制浓度为1.0 mg/mL。 5.2.2 保存 母液和激素配制后，贴标签，记录溶液名称、配置时间、配置者，并在4 ℃条件下保存。母液应于 3个月之内使用，母液无结晶、无异色才能使用。 5.3 基本培养基配制 5.3.1 琼脂融化 以配置1 L培养基为例(下同）,加蒸馏水700 mL，再加入5.5 g～6 g琼脂，加热搅拌使琼脂融化。 5.3.2 糖溶解 琼脂融化后，加入30 g蔗糖，搅拌使糖溶解。 5.3.3 加母液 糖溶解后，按照附录A的要求加母液，搅拌均匀。 5.3.4 培养基定容 搅拌均匀后，加蒸馏水定容至1 L。 5.3.5 基本培养基 pH 值调节 充分搅拌后，将基本培养基pH值调节至5.95～6.0。 5.3.6 基本培养基分装 愈伤诱导、增殖、分化培养使用240 mL规格的培养瓶定量分装，每瓶分装50 mL；生根培养使用350 mL规格的培养瓶，每瓶分装65 mL，分装时勿将培养基沾在培养瓶瓶口。 5.3.7 培养瓶封口 盖紧瓶盖，或用封口膜封口。 2 DB15/T 1940—2020 5.3.8 培养基灭菌 2 用高温高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，蒸气压力102.9 kPa（1.05 kg/cm ），温度121 ℃条件下保持15 min～20 min即可。 5.3.9 培养基冷却 灭菌后的培养基放在无菌环境中冷却，待完全凝固后使用。 5.3.10 培养基贮存 灭菌后的培养基应标明编号、种类、配制日期，在4 ℃无菌条件下贮藏备用，贮存时间不应超过一 个月。 6 外植体 6.1 枝条采集 7月～9月份，选择晴天9:00～11:00或15:00～18:00之间，采集无病虫害、生长健壮的带休眠芽枝 条备用。 6.2 外植体灭菌 6.2.1 表面清洗 将采集的枝条用洗洁精水刷洗表面，用流水冲洗30 min后，剪成带1～2个芽的茎段置于容器中备用。 6.2.2 茎段灭菌 洗涤后的茎段置于烧杯中，在超净工作台上用70 %～75 %酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3～4次，再用 0.1 %升汞浸泡15 min，之后用无菌水冲洗至少5次，再用灭菌滤纸吸附残留水分。 6.3 外植体制备 在超净工作台上，从灭菌的茎段上剥取休眠芽中3 mm～5 mm的茎尖作为外植体备用。 7 初代培养 7.1 培养基 初代培养基为 MS + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L + GA3 0.5 mg/L。 7.2 接种 将外植体均匀接种于培养基上，每瓶接种3～5个，茎尖基部插入培养基1 mm，露出芽，拧紧瓶盖， 标明编号。 7.3 培养 将接种后的培养瓶摆放在培养架上，在温度23 ℃±2 ℃、光照强度2000 Lx～3000 Lx、光照时间 12 h/d～14 h/d，光暗交替培养20 d。 3 DB15/T 1940—2020 8 继代增殖培养 8.1 培养基制备 继代增殖培养基为MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.3 mg/L + GA3 0.5 mg/L。 8.2 接种 在超净工作台上，将初代培养的幼苗切成带1～2个腋芽的小段接种于继代增殖培养基上，每瓶均匀 接种3个，茎段下部插入培养基内1 mm，露出芽，接种后将瓶口迅速在酒精灯火焰上灼烧2 s，盖紧瓶盖， 标明编号。 8.3 培养 将接种后的培养瓶摆放培养架上，在温度23 ℃±2 ℃、光照强度2000 Lx～3000 Lx、光照时间12 h/d～14 h/d，光暗交替培养30 d～50 d。 9 生根培养 9.1 培养基 生根培养基为1/2 MS + NAA 0.2 mg/L + IBA 0.8 mg/L。 9.2 接种 继代增殖培养的不定芽高度达到20 mm～30 mm 时，齐培养基面剪取生长健壮、叶片舒展、叶色正 常的不定芽，接种在生根培养基上，接种深度为3 mm～5 mm，每瓶均匀接种8～10株。接种后将瓶口迅 速在酒精灯火焰上灼烧2 s，盖紧瓶盖，标明编号。 9.3 培养 将接种后的培养瓶摆放在培养架上，在温度23 ℃±2 ℃、光照强度2000 Lx～3000 Lx、光照时间 为12 h/d～14 h/d，光暗交替培养10 d。 10 炼苗 10.1 瓶苗炼苗 选择带有3～5片正常绿叶、苗高50 mm～60 mm的组培苗，置于温度25 ℃±2 ℃、湿度80 %以上、 光照强度1500 Lx～2000 Lx的温室苗床上，松开瓶盖1 d～2 d，然后半开瓶盖1 d～2 d，最后揭去瓶盖 3 d～5 d。温室使用前，用12%百菌清烟雾剂熏蒸3～4次。 10.2 穴盘炼苗 10.2.1 基质 草炭﹕蛭石﹕珍珠岩=3﹕2﹕1混合作为基质。用多菌灵800倍液浸湿基质，用塑料布覆盖灭菌24 h 后使用。 4 DB15/T 1940—2020 10.2.2 穴盘 穴盘规格选用孔径8 cm、深度8 cm。灭菌后的基质填充穴盘容器，喷淋清水保湿，待用。 10.2.3 瓶苗移栽 取出瓶苗，用常温清水洗去残留培养基，穴盘基质扎孔植入瓶苗，置于温室苗床上，常温清水饱和 喷淋1次。 10.2.4 温湿度管理 移栽后，每天雾化喷水，保持环境湿度80 ％～90 ％、温度20 ℃～25 ℃。1周以后，湿度逐渐降 低到70 %，炼苗1个月。 10.2.5 病害防治 移栽后每隔 5 d～7 d喷施800倍液多菌灵，或400倍～700倍代森锰锌，或甲基托布津700倍～1500 倍杀菌剂一次。 11 温室移植培养 11.1 移植 将穴盘中的幼苗连同基质一起移栽到直径18 cm、深度20 cm的相同基质容器中，置于温室苗床上继 续培养。 11.2 培养 11.2.1 育苗环境 温度20 ℃～22 ℃，湿度70 %～80 %，自然光照，通风良好。 11.2.2 水肥管理 移栽后，每天喷水1～2次，培养4 d～5 d， 每隔20 d叶面施肥1次。 11.2.3 病害预防 幼苗期，每隔7 d～10 d喷洒杀菌剂1次，连续喷洒3～4次。 5 DB15/T 1940—2020 AA 附 录 A （规范性附录） MS 培养基母液配制 表A.1 MS 培养基母液配制表 母液名称 大量元素 铁盐 微量元素 编号 A B C 化试名称 有机成分 E 扩大倍数 扩大后称量 母液定容体积 配置培养基吸取量 mg mL mL/L 1000 40 1000 10 500 5 1000 5 500 10 NH4NO3 1650 41250 KNO3 1900 47500 CaCl2·2H2O 440 MgSO4·7H2O 370 9250 KH2PO4 170 4250 FeSO4·7H2O 27.8 25 11000 2780 100 Na2EDTA·2H2O 37.3 MnSO4·4H2O 22.3 100 2230 ZnSO4·7H2O 8.6 100 860 H3BO3 6.2 100 620 KI 0.83 100 83 Na2MoO4·2H2O 0.25 100 25 CuSO4·5H2O 0.025 100 2.5 CoCl2·6H2O 0.025 100 2.5 2 200 400 盐酸硫胺素 B1 0.1 200 20 盐酸吡哆酸 B6 0.5 200 100 烟酸 0.5 200 100 肌醇 100 50 5000 甘氨酸 D mg/L 3730 _________________________________ 6