ICS 65.020.30 B41 DB33 浙 江 省 地 方 标 准 DB33/T 2254—2020 猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒 双重荧光定量 RT-PCR 检测方法 Method of duplex fluorescence quantitative RT-PCR for the detection of porcine epidemic diazhangchenrrhea virus and transmissible gastroenteritis virus 2020 - 04 - 08 发布 浙江省市场监督管理局 2020 - 05 - 08 实施 发 布 DB33/T 2254—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江农林大学。 本标准主要起草人：宋厚辉、邵春艳、王晓杜、孙静、姜胜、周莹珊、杨永春、程昌勇、章先、杨 杨、卫芳芳。 I DB33/T 2254—2020 猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒双重荧光定量 RT-PCR 检 测方法 1 范围 本标准规定了猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和猪传染性胃肠炎 病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）双重荧光定量RT-PCR检测方法的材料准备、样 品采集、核酸提取、荧光定量RT-PCR检测及结果判定。 本标准适用于猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值：达到阈值的循环数（Cycle threshold） DEPC：焦磷酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid） PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline） PEDV：猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus) RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid） RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction） TGEV：猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus） 4 试剂和材料 4.1 除非另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无 RNA 酶的容器分装。0.01 mol/L PBS 和 DEPC 水配制中所使用的水应符合 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法中一级水的要求。 4.2 Trizol：RNA 抽提试剂，2 ℃～8 ℃保存。 4.3 氯仿：2 ℃～8 ℃预冷。 4.4 异丙醇：2 ℃～8 ℃预冷。 4.5 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和 DEPC 水配制，2 ℃～8 ℃预冷。 4.6 DEPC 水：配置方法见附录 A。宜直接购买商品化 DEPC 处理的无 DNA 酶和 RNA 酶的水。 4.7 0.01 mol/L PBS，pH7.2：配制方法见附录 A。 1 DB33/T 2254—2020 2+ 4.8 2×One Step RT-PCR buffer（内含 PCR buffer、dNTPs 和 Mg ）。 4.9 DNA 聚合酶：HS Taq DNA 聚合酶（5 U/µL）。 4.10 反转录酶预混物（内含 RNase 抑制剂）。 4.11 阳性对照：猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎灭活病毒混合物。 4.12 阴性对照：DEPC 水。 4.13 用于 RT-PCR 反应的引物浓度为 10 µmol/L，探针浓度 10 µmol/L，其序列分别为： PEDV 上游引物 F：5’-GCTTGCTTCGGACCCAGAGG -3’； PEDV 下游引物 R：5’-ACGAACAGCCACATTACCACCAA -3’； PEDV 探针 P：5’-TTGGAGATGCGGAATTTGTCGAA-3’，其 5’端和 3’端分别标记 FAM 和 MGB； TGEV 上游引物 F：5’-AAGGAAGATGGCGACCAGATAG-3’； TGEV 下游引物 R：5’-CACTTCTGATGGGCGAGCAT -3’； TGEV 探针 P：5’- CACGTTCACACACAAAT -3’，其 5’端和 3’端分别标记 HEX 和 MGB； 4.14 一次性耗材：乳胶手套，灭菌离心管、荧光 RT-PCR 反应管、无菌 PCR 吸头。 5 器材和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 电热干燥箱。 高压灭菌锅。 高速台式冷冻离心机：可控温至 4 ℃，最大离心速度可达 12 000 r/min 以上。 冷藏冰箱，冷冻冰箱（-80 ℃）。 荧光 PCR 检测仪。 微量移液器。 6 实验室分区 检测实验室应有相应的生物安全设施和功能分区，包括样品处理区、核酸提取区、反应混合物配置 区、加样区和扩增区。各功能区有专用的试剂和实验材料，不可交叉使用。 7 样品的采集与处理 7.1 采样注意事项 采样及样品前处理过程中应无菌操作，防止样本交叉污染。 7.2 采样工具 7.2.1 药匙、剪刀、镊子，经 160 ℃干热灭菌 2 h。 7.2.2 无菌棉拭子。 7.3 采样方法与样品处理 7.3.1 肠内容物的采集与处理 无菌操作采取病死或剖杀猪的小肠内容物 1 g~2 g，置于 15 mL 离心管中，按 1：4 倍体积加入灭 菌的 0.01 mol/L PBS，混匀，反复冻融 3 次。在 4 ℃条件下以 3 000 r/min 离心 20 min，取上清液转 2 DB33/T 2254—2020 入 1.5 mL 离心管中编号备用，待检。 7.3.2 粪便的采集与处理 用灭菌药匙采取发病猪新鲜粪便或用无菌棉拭子采取直肠内粪便，置于 15 mL 离心管中，按 1：4 倍体积加入灭菌的 0.01 mol/L PBS，混匀，反复冻融 3 次。在 4 ℃条件下以 3 000 r/min 离心 20 min， 取上清液转入 1.5 mL 离心管中编号备用，待检。 7.3.3 细胞培养物处理 细胞培养物反复冻融 3 次，转入 1.5 mL 离心管中编号备用。 7.3.4 样品存放与运输 采集的样品密封后，采用保温容器加冰袋或干冰，在 6 h～8 h 之内运送到实验室。采集或处理的 样品在 2 ℃～8 ℃条件下保存不应超过 24 h；若需长期保存，应放置于-80 ℃冰箱中，且应避免反复 冻融，冻融不应超过 3 次。 8 核酸提取 8.1 一般要求 在核酸提取区进行。 8.2 酚-氯仿法抽提核酸 8.2.1 取 n 个 1.5 mL 离心管，其中 n 为待检样品数、2 管阳性对照及 2 管阴性对照之和，对每个离心 管进行编号。 8.2.2 每管加入 500 µL Trizol，分别加入待检样品、阳性对照和阴性对照各 100 µL，颠倒 10 次混 匀，静置 5 min；再加入 200 µL 氯仿，混匀器上振荡混匀 5s，也可用手反复颠倒混匀。于 4℃，12 000 r/min 离心 15 min。检测过程中不得交叉污染。 8.2.3 取与本标准 8.2.1 中相同数量的 1.5 mL 离心管，加入 500 µL 异丙醇，对每个离心管进行编号。 取本标准 8.2.2 中离心后的上清液约 500 µL 转移至相应的离心管中，在吸取上清液时注意不应吸出中 间层，颠倒混匀，-20 ℃静置 30 min。 8.2.4 于 4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入 600 µL 75% 乙醇，颠倒混匀。 8.2.5 于 4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。不同样品应在吸 水纸不同地方沾干。 8.2.6 4 000 r/min 离心 10 s，用微量移液器小心将残余液体吸干，室温放置 3 min～10 min。 8.2.7 加入 30 µL DEPC 水，轻柔混匀，溶解管壁上的 RNA，冰上保存备用。提取的 RNA 应在 2 h 内进 行荧光 RT-PCR 扩增；若需长期保存应放置-80 ℃冰箱。 8.3 核酸提取等效方法 可采用核酸提取试剂盒或全自动核酸抽提仪及配套核酸提取试剂进行核酸抽提。 9 荧光定量 RT-PCR 检测 3 DB33/T 2254—2020 9.1 荧光 RT-PCR 扩增体系的配制 在反应混合物配制区进行。 设荧光 RT-PCR 反应数为 n，其中 n 为待检样品数、2 管阳性对照及 2 管阴性对照之和，每个样品 测试反应体系配制见表 1。配制完毕的反应液分装时应尽量避免产生气泡，转移至加样区加样。 表1 每个样品反应体系配制表 体系组分 用量 2×One Step RT-PCR buffer 10 µL HS Taq 酶 0.4 µL RT Enzyme Mix 0.4 µL PEDV 上游引物 F 0.4 µL PEDV 下游引物 R 0.4 µL PEDV 探针 P 0.4 µL TGEV 上游引物 F 0.4 µL TGEV 下游引物 R 0.4 µL TGEV 探针 P 0.4 µL DEPC 水 4.8 µL 总量 18 µL 9.2 加样 在加样区进行。 在各设定的荧光 RT-PCR 管中分别加入按本标准 8.2.7 中制备的 2 µL RNA 溶液，盖紧管盖后， 3 000 r/min 离心 30 s，上机前注意检查各反应管是否盖紧。 9.3 荧光 RT-PCR 扩增 在扩增区进行。 将按本标准 9.2 离心后的 RT-PCR 管放入荧光 PCR 检测仪内，记录样品摆放顺序。 循环条件设置如下： a) 42 ℃条件下反转录 30 min； b) 95 ℃条件下预变性 10 s； c) 95 ℃条件下变性 5 s；60 ℃条件下扩增 30 s，40 个循环；60 ℃时设置荧光信号的采集。 9.4 荧光通道的设定 PEDV Report Dye 设定为 FAM，Quen