11.020 ICS C 62 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.4—2020 新型冠状病毒检测技术规范 第 4 部分：重组酶介导等温扩增程序 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 4: Recombinase aided amplification test procedure 2020 - 03 - 02 发布 江苏省市场监督管理局 2020 - 03 - 03 实施 发 布 DB32/T 3762.4—2020 目 前 次 言 ............................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 环境与设施 ........................................................................ 2 5 设备与耗材 ........................................................................ 2 6 试剂与材料 ........................................................................ 2 7 样本前处理与核酸提取 .............................................................. 2 8 扩增体系配制与扩增 ................................................................ 2 9 结果判定 .......................................................................... 3 I DB32/T 3762.4—2020 前 言 DB32/T 3762《新型冠状病毒检测技术规范》目前分为以下部分： ——第1部分：生物样本采集、运输和保存； ——第2部分：病毒分离与鉴定； ——第3部分：核酸荧光PCR检测程序； ——第4部分：重组酶介导等温扩增程序； ——第5部分：血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序； ——第6部分：血清IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测程序； ——第7部分：空气样本检测与评估； ——第8部分：物体表面检测与评估； ——第9部分：医务人员职业暴露检测与评估。 本部分为DB32/T 3762 的第4部分。 本部分按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本部分由江苏省卫生健康委员会提出。 本部分由江苏省卫生标准化技术委员会归口。 本部分起草单位：江苏省疾病预防控制中心、南京医科大学、苏州第五人民医院、苏州大学附二院、 昆山市疾病预防控制中心。 本部分主要起草人：朱小娟、朱宝立、崔仑标、葛以跃、程军平、徐佳南、钱志远、罗晓明、沈欢 喜。 II DB32/T 3762.4—2020 新型冠状病毒检测技术规范 第 4 部分：重组酶介导等温扩增程序 1 范围 本部分规定了新型冠状病毒实验室核酸重组酶介导等温扩增检测的环境与设施、设备与耗材、试剂 与材料、样本前处理与核酸提取、扩增体系配制与扩增、结果判定。 本部分适用于新型冠状病毒实验室核酸重组酶介导等温扩增检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 医疗机构临床基因扩增管理办法 原中华人民共和国卫生部办公厅 医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则 原中华人民共和卫生部检验中心 新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国家卫生健康委员会 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 等温扩增 isothermal amplification 在等温条件下，短时间内进行核酸扩增的一种基因扩增方法。 3.2 重组酶介导等温核酸扩增技术 recombinase aided amplification, RAA 一种利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在等温条件下（最佳温度37℃）进行核酸扩增的技 术。其原理为：重组酶、单链结合蛋白、引物形成复合体扫描双链DNA，在与引物同源的序列处使双 链DNA解旋，单链结合蛋白（SSB）防止单链DNA复性，在能量和dNTP存在的情况下，由DNA聚合酶 完成链的延伸，5min～15 min就可实现仪器扩增。 3.3 逆转录 reverse transcription, RT 由一条RNA单链转录为互补DNA，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成，或称反转录。 4 环境与设施 同本标准 第3部分4.1和4.2。 1 DB32/T 3762.4—2020 5 设备与耗材 5.1 设备 生物安全柜、离心机、涡旋振荡器、水浴或金属浴、核酸提取仪、RAA恒温震荡离心仪、RAA恒 温核酸扩增检测仪。 5.2 耗材 N95及以上防护口罩、医用无纺布帽、护目镜、连体防护服、一次性PE手套、一次性手术衣、乳胶 手套、防水靴套、微量移液器及各种配套带滤芯Tip头、1.5 mL EP管、冻存管、冻存盒。 6 试剂与材料 6.1 试剂 核酸提取试剂盒、RT-RAA核酸扩增试剂盒。 6.2 材料 消毒剂：75%乙醇；有效氯5500mg/L的消毒液（需每天新鲜配制）；生理盐水或磷酸盐缓冲液 （PH=7.4）；4%NaOH或含1g/L蛋白酶K的磷酸盐缓冲液或0.1%二硫苏糖醇的磷酸盐缓冲液。 7 样本前处理与核酸提取 同本标准 第3部分7.1和7.2。 8 扩增体系配制与扩增 8.1 RT-RAA 核酸扩增试剂盒在室温融化后，瞬时离心，按 n+1 配置反应体系（n=样本数+1 管阳性 对照+1 管阴性对照），每个反应体系配置如下： 表1 重组酶介导等温扩增反应体系 组成 体积（μL） 灭菌水 12.7 缓冲液Ⅵ 25 上游引物（10 μM） 2.1 下游引物（10 μM） 2.1 探针（10 μM） 0.6 8.2 上述体系配置完成后用手指轻弹混匀，短暂离心。向反应单元中加入 42.5 μL 上述混合液，盖 紧管盖，用手指轻弹混匀，短暂离心。 8.3 打开反应单元管，管盖内侧加入 2.5 μL 乙酸镁。 8.4 向反应单元管中依次加入 5 μL 阴性对照、模板核酸、阳性对照，盖紧管盖。 8.5 将反应管移至 RAA 恒温震荡离心仪中，长按震荡键，39 ℃预处理 7 min。 8.6 上述程序结束后，把反应管立即移到 RAA 恒温核酸扩增检测仪中，点击运行键，39℃运行 30 min。 2 DB32/T 3762.4—2020 9 结果判定 9.1 阳性判断 9.1.1 反应结束后，设置斜率为 20，仪器将自动进行数据分析，自动呈现判定结果； 9.1.2 10 min 内，扩增曲线的斜率≥20 时判断为新型冠状病毒核酸阳性；否则判断为阴性。 9.2 结果分析 9.2.1 阳性质控品为阳性；阴性质控品为阴性。 9.2.2 如检测结果不符合 9.2.1 的要求，该实验视为无效，应检查仪器、试剂等的偏差，确认无误后重 新检测。 _________________________________ 3