ICS 65.150 B 52 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3650—2020 水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 酶联免疫吸附法 Determination of residues of nitrofuran metabolites in aquatic Products ELISA method 文稿版次选择 2020 - 06 - 22 发布 安徽省市场监督管理局 2020 - 07 - 22 实施 发 布 DB34/T 3650—2020 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省水产技术推广总站提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽国泰众信检测技术有限公司、宁国市金东坊农业开发有限公司、宣城市念念 虾稻轮作专业合作社、安徽省水产技术推广总站、合肥市畜牧水产技术推广中心、北京柏奥泰科技有限 公司、合肥金荣生态农业有限公司。 本标准主要起草人：孙德祥、陈洪周、周作友、吴敏、金家红、何广、李瑞、卞红正、许世富、张 武庆、姚杰、李先锋、桂淦、郭恒心、魏泽能、荣朝振、刘传涛、魏涛、钱之云、王婷、刘卫芳、王振、 何超、范希芹、李珺、陈恩全。 I DB34/T 3650—2020 水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了水产品中四种硝基呋喃类代谢物残留量的测定 酶联免疫吸附法的原理、试剂与材料、 仪器和设备、试样制备与保存、测定方法、检测限、准确度和精密度、结果确证。 本标准适用于水产品中呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃西林代谢物、呋喃妥因代谢物残留 量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20752 猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联 质谱法 GB/T 30891 水产品抽样规范 农业部 1192号公告-1-2009 水产苗种违禁药物抽检技术规范 3 原理 试样经衍生化、提取出残留的硝基呋喃代谢物，分别在四种不同的硝基呋喃代谢物检测试剂盒中测 定。试样中残留的硝基呋喃代谢物、HRP 酶标记抗原共同竞争板上的抗体，加TMB底物后的颜色与试样 中残留的硝基呋喃代谢物的含量成反比，用酶标仪在 450 nm 处测定吸光度值，建立标准曲线，得到对 应硝基呋喃代谢物浓度，乘以最终试液体积，除以最终试样质量，即得出含量。 4 试剂与材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的二级水。 4.1 乙酸乙酯：色谱纯 4.2 正己烷：色谱纯 4.3 盐酸溶液[1 mol/L]：取 8.3 ml 的 36％盐酸溶液溶于水中并定容到 100 ml。 4.4 磷酸氢二钾溶液[0.1 mol/L]：称取 17.4 g 的无水磷酸氢二钾溶于水中并定容到 1000 ml。 4.5 氢氧化钠溶液[1 mol/L]：称取 4 g 的氢氧化钠，溶于水中并定容到 100 ml。 4.6 硝基呋喃类代谢物测定试剂盒 ——包括：呋喃唑酮代谢物（AOZ）测定试剂盒、呋喃它酮代谢物（AMOZ）测定试剂盒、呋喃西林 代谢物(SEM)测定试剂盒、呋喃妥因代谢物(AHD)测定试剂盒。 ——组成参见附录 A。 4.6.1 呋喃唑酮代谢物（AOZ）标准系列工作液（ng/mL）：0，0.02，0.06，0.18，0.54，1.62； 1 DB34/T 3650—2020 4.6.2 4.6.3 4.6.4 4.6.5 4.6.6 4.6.7 4.6.8 4.6.9 5 呋喃它酮代谢物（AMOZ）标准系列工作液（ng/mL）：0，0.025，0.1，0.4，1.6，6.4； 呋喃西林代谢物(SEM)标准系列工作液（ng/mL）：0，0.025，0.1，0.4，1.6，6.4； 呋喃妥因代谢物(AHD)标准系列工作液（ng/mL）：0，0.025，0.1，0.4，1.6，6.4； 样品提取液：将水与试剂盒中 10×浓缩提取液，按 1﹕9 的比例混合配置。 衍生化试剂：试剂盒自带 50 mmol/L 的 2-硝基苯甲醛。 洗液：将水与试剂盒中 20×浓缩洗液，按 1：19 的比例混合配制。 TMB 底物。 终止液。 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6 酶标仪：配备 450 nm 滤光片。 分析天平： 0.01g。 组织捣碎机。 漩涡仪。 恒温振荡器。温控范围：室温～100℃，温控精度：±0.5℃ 离心机：离心力大于 4500 g。 氮吹仪：温控范围：室温～100℃ 恒温培养箱：温控范围：0～60℃，温度均匀度：±0.5℃ 可调移液器 ——单道 20 μL～200 μL、100 μL～1000 μL、500 μL～5000 μL； ——八道 50μL～300 μL。 试样制备和保存 6.1 试样制备 水产品按 GB/T 30891 的规定执行；水产苗种按农业部 1192号公告-1-2009 的规定执行。 采用四分法，将样品分成两等份，装入洁净容器，加封并做标识。 ——取均质后的供试样品，作为供试试样。 ——取均质后的空白样品，作为空白试样。 ——取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。 6.2 试样保存 于 -18℃条件下避光保存，保存期 6 个月。 7 测定方法 7.1 操作条件 所有操作应在 20℃～25℃室温下进行。AOZ、AMOZ、SEM 和 AHD 测定试剂盒及所有试剂，使用前 应提前 60 min 以上取出，回升至室温后方可使用。 7.2 2 试样提取和净化 DB34/T 3650—2020 称取 1 g ± 0.02 g 试样置于 50 mL 离心管中，加入 0.5 mL 样品提取液（4.6.5）、3.5 mL 水、 0.5 mL 盐酸溶液（4.3）和 80 μL 衍生化试剂（4.6.6），剧烈振荡 1 min，置于恒温振荡器中 60℃ 避光振荡 3 h 或 37℃ 避光振荡 16 h，加入 5 mL 磷酸氢二钾溶液（4.4），0.4 mL 氢氧化钠溶液（4.5）， 涡旋 30 s ，加 6 mL 乙酸乙酯（4.1），涡旋振荡 1 min，离心力 4000 g 离心 15 min.。取出 3 mL 的上清液（相当于含 0.5 g 原始试样）到另一个 5 mL 离心管中，于 60℃氮气吹近干。加 2 mL 正己 烷（4.2）溶解干燥物，加 1 mL 样品提取液（4.6.5）充分混合振荡 1 min，离心力 4500 g 下离心 10 min，去除正己烷层和中间相，下清液用作试液。 此最终试液体积（v）为 1 mL，所代表的最终试样质量（m）为 0.5 g。 7.3 酶联免疫测定 7.3.1 测定步骤 将测定需要的微孔条插入板架（标准工作液、试液和空白样及质控样分别作平行试验测定），记录 相应的位置。在每孔中，加入 100 μL 标准工作液或 7.2 中的试液，50 μL 酶标抗原，轻敲微孔板边 缘混匀 1 min，盖上板膜，放入恒温培养箱中于 22.5℃±2.5℃避光孵育 30 min；取出酶标板，微孔 向下甩出液体，每孔加入 250 μL 洗涤液（4.6.7），轻敲酶标板边缘混匀 15 s 后甩出液体，重复 3 次， 在吸水纸上拍打，完全去除孔中液体。每孔加入 100 μL TMB 底物（4.6.8），盖上板膜，放入恒温培 养箱中于 22.5℃±2.5℃避光孵育 20 min 后，加入 100 μL 终止液（4.6.9），轻轻振荡混匀，用酶 标仪于 450 nm 处测定吸光度值(读数前，使用无绒布擦拭微孔底部水分和指模)。 注1：不同试剂盒制造商间的产品组成和操作会有差别，应严格按说明书要求规范操作。 注2：呋喃唑酮代谢物（AOZ）、呋喃它酮代谢物（AMOZ）、呋喃西林代谢物(SEM)、呋喃妥因代谢物(AHD)，应分别 用对应的酶联免疫检测试剂盒测定。 7.3.2 空白试验 除不称取试样外，均按 7.2 至 7.3.1 步骤进行。 7.4 结果计算 7.4.1 百分吸光率的计算 标准品或样品的百分吸光率按式（1）计算，百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均 值（双孔）除以 0 浓度标准工作液的吸光度值，再乘以 100％，见式(1)： 相对吸光度值 A(％)= B ×100％ ........................... (1) B0 式中： A——标准工作液或试液的百分吸光率，％； B——非 0 浓度标准工作液或试液的平均吸光度值，％； B0——0 浓度标准工作液（ng/mL）的平均吸光度值，％。 7.4.2 标准曲线的绘制与计算 以相对吸光度值(％)为纵坐标，标准点浓度（ng/mL）为横坐标建立标准曲线。从校正曲线算出对 应的试样中硝基呋喃类代谢物浓度（c），再乘以最终试液体积（v），除以最终试样质量（m），即可 得出试样中硝基呋喃类代谢物残留量的结果，按式(2)计算： 3 DB34/T 3650—2020 X=c× v 1000 × m 1000 .................................. (2) 式中： X——硝基呋喃类代谢物含量，单位为微克每千克（μg/kg）； c——从校正曲线算出试样中的硝基呋喃类代谢物浓度（ng/mL）； v——检测液最终试液体积，单位为毫升（mL）； m——检测液所代表的最终试样质量，单位为克（g）。 计算结果应扣除空白值。 注：结果保留三位有效数字。 7.5 质量控制 7.5.1 质控要求 每一批测定均应进行平行试验、空白试样测定和空白添加测定。 7.5.2 质控方式 7.5.2.1 平行试验 按以上步骤，对同一标准溶液、试样溶液、空白及质控溶液应进行两个平行试验测定。 7.5.2.2 空白试样测定 测定结果应为阴性。 7.5.2.3 空白添加试样测定 用空白试样添加硝基呋喃代谢物标准溶液，添加浓度水平为试剂盒检测限和相关产品的 0.5 μg/kg 或最大残留限量值。 8 检测限、回收率和精密度 8.1 检测限 本方法中 AOZ、AMOZ、SEM 和 AHD 的检测限均为 0.05 μg/kg。 8.2 回收率 AMOZ、SEM 和 AHD 空白试样中添加 0.05 μg/kg～5 μg/kg，AOZ 空白试样中添加 0.05 μg/kg